Shanghan Yimiao

Typhoid Vaccine

本品系用伤寒沙门菌培养制成悬液，经甲醛杀菌，用PBS稀释制成。用于预防伤寒。

生产和检定用设施、原材料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”的有关要求。

2.1  菌种

　　生产用菌种应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理及质量控制”的有关规定。

　　2.1.1  名称及来源

　　采用伤寒沙门菌CMCC50098（Ty2株）和CMCC50402。

　　2.1.2  种子批的建立

　　应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理及质量控制”的有关规定。

　　2.1.3  种子批的传代

　　主种子批菌种启开后传代次数不得超过5代；工作种子批菌种启开后至接种生产用培养基传代次数不得超过5代。

　　2.1.4  种子批的检定

　　2.1.4.1  培养特性

　　将待检菌种接种于肉汤琼脂、马丁琼脂或其他适宜的培养基，置37℃培养18～20小时，应为无色半透明、边缘整齐、表面光滑湿润的圆形菌落。

　　2.1.4.2  染色镜检

　　应为革兰氏阴性杆菌。

　　2.1.4.3  生化反应

　　发酵葡萄糖、麦芽糖、甘露醇均产酸不产气；不发酵乳糖、蔗糖（通则3605）；氧化酶试验阴性。

　　2.1.4.4  血清学特性

　　（1）玻片凝集试验

　　待检菌种的新鲜培养物与Vi及H-d参考血清有强凝集反应（+++以上），与Ｏ-9参考血清不产生凝集反应或仅有较弱凝集。

　　（2）定量凝集试验

　　将待检菌种的新鲜培养物，用PBS制成6.0×10⁸/ml的菌悬液，与伤寒沙门菌参考血清做定量凝集试验。充分混匀后，置35～37℃过夜。肉眼观察结果，以（+）凝集之血清最高稀释度为凝集反应效价，凝集效价应不低于参考血清原效价之半。

　　2.1.4.5  毒力试验

　　用35～37℃培养12～16小时的琼脂培养物，以0.85%～0.90%氯化钠溶液稀释成含菌6.0×10^8/ml、3.0×10⁸/ml、1.5×10⁸/ml及7.5×107/ml等浓度的菌悬液（根据菌种毒力情况，稀释度可作更改）。每一稀释度的菌悬液腹腔注射至少5只体重14～16g小鼠，每只0.5ml，观察3天。小鼠感染后3天内全部死亡的最小剂量为1个最小致死量（MLD），1MLD含菌应不高于1.5×10⁸。

　　2.1.4.6  毒性试验

　　将35～37℃培养18～20小时之琼脂培养物混悬于PBS内，56℃加温1小时（或其他方法杀菌），不加抑菌剂。杀菌检查合格后稀释成6.0×10⁹/ml、3.0×10⁹/ml及1.5×10⁹/ml3个浓度，每个浓度的菌悬液以0.5ml腹腔注射体重15～18g小鼠5只，观察3天，注射含菌7.5×10⁸之小鼠应全部生存，注射含菌1.5×10⁹之5只小鼠可有3只死亡。

　　2.1.4.7免疫力试验

　　将经56℃30分钟加温（或用其他方法杀菌）不加抑菌剂的菌液稀释为2.5×108/ml。用该菌液免疫体重14～16g小鼠至少30只，每只皮下注射0.5ml，注射2次，间隔7天，末次免疫后9～11天进行毒菌攻击。免疫组小鼠每只腹腔注射0.5ml含1MLD的毒菌，同时应用同批饲养或体重与免疫组相同的小鼠3组（每组至少5只）作对照，分别于腹腔注射2MLD、1MLD及1/2MLD的毒菌（各含于0.5ml中）。观察3天，对照组小鼠感染2MLD及1MLD者应全部死亡，感染1/2MLD者有部分死亡。免疫组小鼠存活率应不低于70%。

　　免疫力试验也可用LD₅₀攻击法。将经56℃30分钟加温（或用其他方法杀菌）不加抑菌剂的菌液稀释为2.5×108/ml。用该菌液免疫体重14～16g小鼠至少30只，每只皮下注射0.5ml，注射2次，间隔7天，末次免疫后9～11天进行毒菌攻击。用培养12～16小时的菌苔，以pH7.2～7.4的肉汤培养基或0.85%～0.90%氯化钠溶液稀释至适当浓度，进行攻击。免疫组小鼠应感染100LD₅₀以上的毒菌。同时应用同批饲养或体重与免疫组相同的小鼠3～4组（每组至少5只），分别感染不同剂量毒菌作对照。免疫组及对照组分别腹腔注射0.5ml，观察3天，计算LD50。免疫组小鼠存活率应不低于70%。

　　应同时用参考菌苗作对照。

　　2.1.4.8抗原性试验

　　选用体重2kg左右之健康家兔至少3只，用经56℃30分钟加温（或用其他方法杀菌）不加抑菌剂之菌液静脉注射3次，每次0.5ml，第一次注射含菌7.0×10⁸，第二次注射含菌1.4×10⁹，第三次注射含菌2.1×10⁹，每次间隔7天。末次注射后10～14天采血做定量凝集试验测定效价，2/3家兔血清之凝集效价应不低于1∶12800。

　　2.1.5种子批的保存

　　种子批应冻干保存于8℃及以下。

　　2.2原液

　　2.2.1生产用种子

　　工作种子批检定合格后方可用于生产，将工作种子批菌种接种于改良半综合培养基或其他适宜培养基，制备生产用种子。

　　2.2.2生产用培养基

　　采用pH7.2～7.4的马丁琼脂、肉汤琼脂或经批准的其他培养基。

　　2.2.3菌种接种和培养

　　采用涂种法接种，接种后置35～37℃培养18～24小时。

　　2.2.4收获

　　刮取菌苔混悬于PBS中即为原液。逐瓶做纯菌检查，取样接种琼脂斜面2管，分别置35～37℃培养2天，24～26℃培养1天，如有杂菌生长应废弃。

　　2.2.5杀菌

　　在纯菌检查合格的原液中加入终浓度为1.0%～1.2%的甲醛溶液，置37℃杀菌，时间不得超过7天，再保存于2～8℃。

　　2.2.6杀菌检查

　　杀菌后，取样接种于不含琼脂的硫乙醇酸盐培养基及普通琼脂斜面各1管，置35～37℃培养5天。如有本菌生长，可加倍量复试1次。如有杂菌生长应废弃。

　　2.2.7合并

　　杀菌检查合格之原液按不同菌株或不同制造日期分别除去琼脂及其他杂质，进行合并。合并后应加入不高于3.0g/L的苯酚或其他适宜抑菌剂，保存于2～8℃。

　　2.2.8原液检定

　　按3.1项进行。

　　2.2.9保存及有效期

　　原液应保存于2～8℃。原液自收获之日起至用于菌苗稀释不得少于4个月，自收获之日起，有效期为30个月。

　　2.3半成品

　　2.3.1配制

　　稀释前应先将不同菌株所制之原液按菌数等量混合，但每个菌株所加的菌数与应加菌数在总菌数不变的原则下允许两个菌株之间在40%范围内互有增减。用含不高于3.0g/L的苯酚或其他适宜抑菌剂的PBS稀释。稀释后浓度为每1ml含伤寒沙门菌3.0×108。

　　2.3.2半成品检定

　　按3.2项进行。

　　2.4成品

　　2.4.1分批

　　应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定。

　　2.4.2分装

　　应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定。

　　2.4.3规格

　　每瓶5ml。每1次人用剂量0.2～1.0ml（根据年龄及注射针次不同），含伤寒沙门菌6.0×107～3.0×108。

　　2.4.4包装

　　应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定。

3.1 原液检定

　　3.1.1 染色镜检

　　革兰氏阴性杆菌，不得有杂菌。

　　3.1.2 凝集试验

　　与相应血清进行定量凝集试验，其凝集效价应不低于血清原效价之半。

　　3.1.3 浓度测定

　　按“中国细菌浊度标准”测定浓度。

　　3.1.4 无菌检查

　　依法检查（通则1101），应符合规定。

　　3.1.5 免疫力试验

　　无菌检查合格后进行本试验，抽检批数应不少于生产批数的1/5。按2.1.4.7项进行，每组小鼠至少15只，60%免疫小鼠存活为合格。

　　3.2 半成品检定

　　无菌检查

　　依法检查（通则1101），应符合规定。

　　3.3 成品检定

　　3.3.1 鉴别试验

　　与相应血清做玻片凝集试验，应出现明显凝集反应。

　　3.3.2 物理检查

　　3.3.2.1 外观

　　应为乳白色悬液，无摇不散的菌块或异物。

　　3.3.2.2 装量

　　依法检查（通则0102），应不低于标示量。

　　3.3.3 化学检定

　　3.3.3.1 pH值

　　应为6.8～7.4（通则0631）。

　　3.3.3.2 苯酚含量

　　应不高于3.0g/L（通则3113）。

　　3.3.3.3 游离甲醛含量

　　应不高于0.2g/L（通则3207第一法）。

　　3.3.4 菌形及纯菌检查

　　染色镜检，应为革兰氏阴性杆菌。至少观察10个视野，平均每个视野内不得有10个以上非典型菌（线状、粗大或染色可疑杆菌），并不应有杂菌。

　　3.3.5 无菌检查

　　依法检查（通则1101），应符合规定。

　　3.3.6 异常毒性检查

　　依法检查（通则1141），应符合规定。每只豚鼠注射剂量为1.5ml。

于2～8℃避光保存和运输。自生产之日起，有效期为18个月。如原液超过1年稀释，应相应缩短有效期（自原液收获之日起，总有效期不得超过30个月）。

应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定和批准的内容。

中华人民共和国药典：2020年版.三部/国家药典委员会编. —北京：中国医药科技出版社，2020.5 ISBN 978-7-5214-1575-9