23 Jia Feiyanqiujun Duotang Yimiao

23-valent Pneumococcal Polysaccharide Vaccine

本品系采用1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F型肺炎链球菌分别进行液体培养，经提取和纯化获得荚膜多糖抗原后稀释合并制成。用于预防由上述23种血清型肺炎链球菌引起的肺炎、脑膜炎、中耳炎和菌血症等疾病。

生产和检定用设施、原材料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”的有关要求。

2.1  菌种

　　生产用菌种应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理及质量控制”的有关规定。

　　2.1.1  名称及来源

　　生产用菌种为23种血清型肺炎链球菌菌种（1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F型），来自中国医学细菌保藏管理中心或其他经批准的菌种。

　　2.1.2  种子批的建立

　　应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理及质量控制”的有关规定。

　　2.1.3  种子批的传代

　　主种子批启开后至工作种子批，传代应不超过5代；工作种子批启开后至接种发酵罐培养，传代应不超过5代。

　　2.1.4  种子批的检定

　　2.1.4.1  培养特性

　　菌种接种于适宜的培养基上，于35~38℃二氧化碳环境中培养16~24小时，长出圆形、湿润、灰白色或灰色的菌落，并且有α-溶血现象。菌苔易取下，在0.85%~0.90%氯化钠溶液中呈现均匀混悬液。

　　2.1.4.2  染色镜检

　　应为革兰氏阳性球菌，有荚膜，可呈链状排列。

　　2.1.4.3  生化反应

　　除另有规定外，应发酵葡萄糖、菊糖、棉子糖、蜜二糖，不发酵山梨醇。

　　2.1.4.4  胆汁溶菌试验

　　加数滴10%脱氧胆酸钠溶液于菌液中，肺炎链球菌应被溶解。

　　2.1.4.5  奥普托欣试验

　　奥普托欣纸片周围应出现抑菌圈，且直径大于14mm。

　　2.1.4.6  荚膜肿胀试验

　　将菌苔分别加入到对照区的0.85%~0.90%氯化钠溶液和阳性区的对应型特异性肺炎链球菌抗血清中，与对照区菌体相比较，阳性区菌体周围应可见明显无色荚膜。

　　2.1.5  种子批的保存

　　种子批保存应符合批准的要求。

　　2.2  原液

　　2.2.1  生产用种子

　　启开工作种子批菌种，经适当传代、染色镜检合格后接种于培养基上，制备数量适宜的生产用种子。

　　2.2.2  生产用培养基

　　采用肺炎球菌半综合液体培养基或经批准的其他适宜培养基。培养基不应含有对人体有害或过敏原物质。

　　2.2.3  培养

　　采用培养罐液体培养。在培养过程中取样涂片做革兰氏染色镜检，如发现污染杂菌，应废弃。

　　2.2.4  收获及杀菌

　　于对数生长期的后期收获，取样进行菌液浓度测定及纯菌检查，在收获的培养液中加入脱氧胆酸钠杀菌，杀菌条件以确保杀菌完全又不损伤其多糖抗原为宜。

　　2.2.5  多糖的粗制

　　2.2.5.1  超滤浓缩

　　离心去菌体后的上清，超滤浓缩。

　　2.2.5.2  收集上清液

　　根据不同血清型多糖特点，除另有规定外，其他型别在超滤浓缩液中加入适宜试剂，调pH值，加入乙醇至适宜浓度，离心收集上清液。

　　2.2.5.3  沉淀粗糖

　　根据不同血清型多糖特点，除另有规定外，取上清液或超滤浓缩液，加入乙酸钠至适宜浓度，调pH值，加乙醇至适宜浓度，沉淀多糖；离心收集沉淀；经有机溶剂洗涤、真空干燥后收获粗制多糖，或按照经批准的工艺沉淀粗糖。

　　2.2.6  多糖的精制

　　2.2.6.1  去除蛋白质

　　采用冷酚法或经批准的方法去除蛋白质。

　　2.2.6.2  去除核酸

　　除另有规定的血清型别外，采用乙醇沉淀法或经批准的方法去除核酸。

　　2.2.6.3  沉淀精糖

　　经有机溶剂洗涤，真空干燥，收获精制多糖，或经批准的方法进行精糖沉淀。

　　2.2.7  精制多糖检定

　　按3.1项进行。

　　2.2.8  保存及有效期

　　于-20℃以下保存。自收获杀菌之日起，疫苗总有效期应不超过60个月。

　　2.3  半成品

　　2.3.1  配制

　　分别取各单价精制多糖或各单价多糖原液适量，合并稀释配制成23价肺炎球菌多糖疫苗，使各单型精制多糖终浓度为50μg/ml，除菌过滤后分装。

　　2.3.2  检定

　　按3.2项进行。

　　2.4  成品

　　2.4.1  分批

　　应符合“生物制品分包装及贮运管理”的有关规定。

　　2.4.2  分装

　　应符合“生物制品分包装及贮运管理”的有关规定。

　　2.4.3  规格

　　每1次人用剂量0.5ml，含23价肺炎球菌荚膜多糖各25μg。

　　2.4.4  包装

　　应符合“生物制品分包装及贮运管理”的有关规定。

3.1  单型精制多糖检定

　　3.1.1  鉴别试验

　　采用免疫双扩散法（通则3403），各单型多糖应与其相应的特异性抗血清产生明显沉淀线；或用速率比浊法（3.3.2），应可测出各单型多糖含量。

　　3.1.2  化学检定

　　3.1.2.1  固体总量

　　依法测定（通则3101），各型精制多糖干燥至恒重。

　　3.1.2.2  蛋白质含量

　　依法测定（通则0731），各型蛋白质含量限度见附表。

　　3.1.2.3  核酸含量

　　依法测定（通则0401），核酸在260nm波长处的吸收系数（）为200，各型核酸含量限度见附表。

　　3.1.2.4  O-乙酰基含量

　　依法测定（通则3117）1型和11A型精制多糖的O-乙酰基含量，含量限度见附表。

　　3.1.2.5  磷含量

　　依法测定（通则3103）或采用经批准的其他方法，各型磷含量限度见附表。

　　3.1.2.6  糖醛酸含量

　　依法测定（通则0401）或采用经批准的其他方法。

　　精确称定D-糖醛酸10mg，加水溶解并定容至200ml，制备100μg/ml糖醛酸对照品溶液。[1]取供试品，用水稀释成糖醛酸浓度低于50μ/ml的供试品溶液。

　　精确量取糖醛酸对照品溶液0ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml和1.0ml分别于玻塞试管中，加水补至1ml/管（糖醛酸含量分别为0μg、10μg、20μg、30μg、40μg和50μg），在搅拌状态下滴加0.955%硼酸盐-硫酸溶液5ml，加塞，于100℃水浴15分钟，冷却至室温后，加0.2ml 0.125%的咔唑-乙醇溶液，加塞，于100℃水浴15分钟，冷却至室温后，于530nm波长处读取各管的吸光度值，同时以空白管（糖醛酸含量为0）作为对照。

　　精确量取供试品溶液1ml于玻塞试管中，平行测定两管，自“在搅拌状态下滴加0.955%硼酸盐-硫酸溶液5ml”起同法操作。

　　以糖醛酸对照品溶液系列浓度（μg/ml）对其相应的吸光度值作直线回归，求得直线回归方程。将供试品溶液的吸光度值带入直线回归方程中，根据稀释倍数计算求出供试品的糖醛酸含量，再以多糖干重计算出糖醛酸的百分含量。

　　1、2、3、5、8、9N、9V、22F型精制多糖的糖醛酸含量限度见附表。

　　3.1.2.7  甲基戊糖含量

　　依法测定（通则0401）或采用经批准的其他方法。

　　精确称定甲基戊糖（鼠李糖）0.1g，加水溶解定容至100ml，摇匀，制备1mg/ml甲基戊糖对照品贮备液（-20℃保存，有效期3个月，临用前50倍稀释，制得20μg/ml甲基戊糖对照品溶液）。

　　精确量取20μg/ml甲基戊糖对照品溶液0ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml和1.0ml分别于玻塞试管中，补水至1ml，以对照品管中的空白管（甲基戊糖含量为0）作为对照，于冰浴中，在连续搅拌下滴加预冷的硫酸溶液4.5ml，加塞，温暖试管至室温后，于100℃水浴至少5分钟，冷却至室温，于各管中加3%巯基丙氨酸（半胱氨酸）盐酸溶液0.1ml，混合均匀，加塞，置室温放置1~2小时，各管于396nm和430nm波长处测定吸光度A值，同时以空白管作为对照。

　　取供试品，用水稀释成甲基戊糖浓度低于20μg/ml的溶液。精确量取1.0ml供试品溶液于玻塞试管中，平行测定两管，自“于冰浴中，在连续搅拌下滴加预冷的硫酸溶液4.5ml”起同法操作。

　　以对照品溶液系列浓度（μg/ml）对其相应的校正吸光度值（A396~A430nm）作直线回归，求得直线回归方程。将供试品溶液的校正吸光度值（A396~A430nm）带入直线回归方程中，根据稀释倍数计算求出供试品的甲基戊糖含量，再以多糖干重计算出甲基戊糖的百分含量。

　　2、6B、7F、17F、18C、19A、19F、22F、23F型精制多糖的甲基戊糖含量限度见附表。

　　3.1.2.8  氨基己糖含量

　　依法测定（通则0401）或采用经批准的其他方法。

　　精密称定D-盐酸氨基葡萄糖或葡糖胺对照品适量，制成氨基己糖含量为500μg/ml的溶液。精密量取500μg/ml葡糖胺对照品溶液0ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml和1.0ml，分别置于20ml具塞玻璃试管中。

　　水解  加适当浓度HCl溶液1ml，加塞并于100℃水浴加热。冷却水解溶液至室温，加指示液（0.5%酚酞乙醇溶液或0.5%麝香草酚酞乙醇溶液），混合均匀，用4mol/L NaOH溶液中和水解溶液至变色，然后滴加1mol/LHCl溶液，直至溶液无色，加水至10ml，此为中性水解溶液。精密量取1ml中性水解溶液于玻塞试管中，平行测定两管，于各管中分别加1ml乙酰丙酮试剂或1ml的1:50（体积比）乙酰丙酮-碳酸钠溶液，加塞，于90℃水浴加热45分钟，冷却溶液至室温，各管中加入无水乙醇2.5ml，混匀，各管缓慢加入1.0ml对二甲氨基苯甲醛溶液，混匀。补加无水乙醇至10ml，混匀，加塞，于室温避光放置1~1.5小时，于530nm波长处测定吸光度值，同时以标准管中的空白管作为对照。

　　精密量取1.0ml供试品溶液于玻塞试管中，自“加适当浓度HC1溶液1ml”起同法操作。

　　以对照品溶液系列浓度（μg/ml）对其相应的吸光度值作直线回归，求得直线回归方程。将供试品溶液的吸光度值带入直线回归方程中，根据稀释倍数计算求出供试品的氨基己糖含量，再以多糖干重计算出氨基己糖的百分含量。

　　4、5、9N、9V、10A、12F、14、15B、19A、19F、20型精制多糖的氨基己糖含量限度见附表。

　　3.1.2.9  总氮含量

　　依法测定（通则0704）或采用经批准的其他方法，各型总氮含量限度见附表。

　　3.1.2.10  分子大小测定

　　第一法  仪器法

　　本法用于测定细菌荚膜多糖在色谱柱中的分配系数（KD）。1、2、3、4、7F、8、9N、12F、14、18C、19A、19F和23F型多糖采用琼脂糖4B或琼脂糖CL-4B凝胶过滤法测定；5、6B、9V、10A、11A、15B、17F、20、22F和33F型多糖采用琼脂糖2B或琼脂糖CL-2B凝胶过滤法测定。

　　试剂、色谱柱的制备与色谱柱标定同通则3419第二法。

　　测定法  取供试品约1ml（含多糖抗原2~5mg），加于已标定的色谱柱中，用流动相洗脱，流速为每小时15~20ml，用示差折光检测器检测，记录色谱图，即得。

　　按下式计算：

　　K_D=（V_e-V₀）/（V_i-V₀）

　　式中 K_D为供试品分配系数；

　　V_e为供试品洗脱液体积，ml；

　　V0为空流体积，ml；

　　V_i为柱床体积，ml。

　　第二法  糖含量测定法（蒽酮硫酸法）

　　试剂、色谱柱的制备与色谱柱标定同通则3419第一法。

　　测定法  取供试品约1ml（含多糖抗原2~5mg），加于已标定的色谱柱中，用流动相洗脱，流速为每小时15~20ml，用组分收集器收集洗脱液，每管收集3~5ml，照下述方法测定每管洗脱液的糖含量。以供试品每管洗脱液的糖含量为纵坐标，洗脱液体积（ml）为横坐标，主峰峰顶洗脱液体积为Ve。

　　按下式计算：

　　K_D=（V_e-V₀）/（V_i-V₀）

　　式中 KD为供试品分配系数；

　　V_e为供试品洗脱液体积，ml；

　　V₀为空流体积，ml；

　　V_i为柱床体积，ml。

　　糖含量测定（蒽酮硫酸法）以0.85%~0.90%氯化钠溶液稀释无水葡萄糖标准品，制备0~100μg/ml葡萄糖标准品溶液。将硫酸225ml加入75ml 0.85%~0.90%氯化钠溶液中，另称取蒽酮0.3g加入10ml乙醇中，将上述溶液混合，配制成蒽酮混合液。分别精确量取1.0ml不同浓度葡萄糖标准品溶液以及各管洗脱液，加入4.0ml蒽酮混合液，混匀，置沸水浴20分钟后再于40℃水浴10分钟后，在波长620nm处测定吸光度，以葡萄糖标准品溶液浓度对应其吸光度，用直线回归法计算糖含量。

　　【附注】过柱操作在10~20℃进行。

　　各型多糖分子KD值见附表。

　　3.1.2.11  有机溶剂残留量

　　依法检查（通则0861）或采用经批准的其他方法，应符合批准的要求。

　　也可在3.3“成品检定”项下进行。

　　3.1.3  细菌内毒素检查

　　依法检查（通则1143），各型多糖细菌内毒素含量应不高于1EU/μg。

　　3.2  半成品检定

　　无菌检查

　　依法检查（通则1101），应符合规定。

　　3.3  成品检定

　　3.3.1  鉴别试验

　　按3.1.1项方法进行。

　　3.3.2  各型多糖含量测定

　　采用免疫化学法（通则3429）速率散射比浊法测定。取多糖标准品制备标准品溶液，与多糖特异性血清反应，通过浊度仪获取标准曲线，CV应小于15%，R值应大于0.985。将供试品稀释至适宜浓度，与多糖特异性血清反应，通过浊度仪检测各型多糖含量，CV应小于15%。各型多糖含量应为（50±15）μg/ml（或应为标示量的70%~130%）。

　　3.3.3  物理检查

　　3.3.3.1  外观

　　应为无色透明液体。

　　3.3.3.2  装量

　　依法检查（通则0102），应不低于标示量。

　　3.3.4  化学检定

　　3.3.4.1  pH值

　　依法测定（通则0631），应符合批准的要求。

　　3.3.4.2  渗透压摩尔浓度

　　依法测定（通则0632），应符合批准的要求。

　　3.3.4.3  苯酚含量

　　如添加苯酚作抑菌剂，依法测定（通则3113），应符合批准的要求。

　　3.3.5  无菌检查

　　依法检查（通则1101），应符合规定。

　　3.3.6  异常毒性检查

　　依法检查（通则1141），应符合规定。注射剂量为每只小鼠0.5ml，含1次人用剂量；每只豚鼠5ml，含10次人用剂量。

　　3.3.7  热原检查

　　依法检查（通则1142）。注射剂量按家兔体重每kg注射1ml，含每型多糖2.5μg，应符合规定。

　　3.3.8  细菌内毒素检查

　　依法检查（通则1143），每1次人用剂量应不高于25EU。

于2~8℃避光保存和运输。自生产之日起，有效期为24个月。

应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定和批准的内容。

中华人民共和国药典：2020年版.三部/国家药典委员会编. —北京：中国医药科技出版社，2020.5 ISBN 978-7-5214-1575-9