XifuWuxibaoBaiBaiPoLianheYimiao

Diphtheria,TetanusandAcellularPertussisCombinedVaccine,Adsorbed

本品系由无细胞百日咳疫苗原液、白喉类毒素原液及破伤风类毒素原液加入氢氧化铝佐剂制成。用于预防百日咳、白喉、破伤风。

生产和检定用设施、原材料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”的有关要求。

2.1  混合前单价原液

　　2.1.1  无细胞百日咳疫苗原液制造应符合本品种附录的规定。

　　2.1.2  白喉类毒素原液制造应符合“吸附白喉疫苗”中2.1~2.2项的规定。

　　2.1.3  破伤风类毒素原液制造应符合“吸附破伤风疫苗”中2.1~2.2项的规定。

　　2.1.4  原液检定

　　2.1.4.1  百日咳疫苗原液检定

　　按本品种附录中2项进行。

　　2.1.4.2  白喉类毒素原液检定

　　按“吸附白喉疫苗”中3.1项进行。

　　2.1.4.3  破伤风类毒素原液检定

　　按“吸附破伤风疫苗”中3.1项进行。

　　2.2  半成品

　　2.2.1  佐剂配制

　　佐剂的制备和检定（通则3650）应符合批准的要求。

　　2.2.2  合并及稀释

　　将白喉类毒素、破伤风类毒素及无细胞百日咳疫苗原液加入已稀释的佐剂内，调pH值至5.8~7.2，使每1ml半成品含无细胞百日咳疫苗原液应不高于18μgPN；白喉类毒素应不高于25Lf；破伤风类毒素应不高于7Lf。

　　2.2.3  半成品检定

　　按3.1项进行。

　　2.3  成品

　　2.3.1  分批

　　应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定。

　　2.3.2  分装

　　应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定。

　　2.3.3  规格

　　每瓶0.5ml、1.0ml、2.0ml、5.0ml。每1次人用剂量0.5ml，含无细胞百日咳疫苗效价应不低于4.0IU，白喉疫苗效价应不低于30IU，破伤风疫苗效价应不低于40IU。

　　2.3.4  包装

　　应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定。

3.1  半成品检定

　　3.1.1  无菌试验

　　依法检查（通则1101），应符合规定。

　　3.1.2  吸附率检查

　　将供试品离心取上清液，同时取供试品进行适当稀释，选取0~100μg/ml范围作为对照品溶液浓度，依法测定[通则0731第二法福林酚法（Lowry法）方法2]供试品及其上清液的蛋白含量，再按下式计算吸附率，应不低于95%。

式中  P为吸附率，%;

　　c_s为供试品上清液的蛋白含量，μg/ml；

　　c_t为供试品的蛋白含量，μg/ml。

　　3.2  成品检定

　　3.2.1  鉴别试验

　　3.2.1.1  无细胞百日咳疫苗

　　可选择下列一种方法进行：（1）疫苗注射动物应产生抗体（按3.2.4.1项进行）；（2）采用酶联免疫吸附法检测PT、FHA抗原，应含有相应抗原（通则3417）；（3）其他适宜的抗原抗体反应试验。

　　3.2.1.2  白喉类毒素

　　可选择下列一种方法进行：（1）疫苗注射动物应产生抗体（通则3505）；（2）疫苗加枸椽酸钠或碳酸钠将佐剂溶解后，做絮状试验（通则3506），应岀现絮状反应；（3）疫苗经解聚液溶解佐剂后取上清液，做凝胶免疫沉淀试验（通则3403），应出现免疫沉淀反应。

　　3.2.1.3  破伤风类毒素

　　可选择下列一种方法进行：（1）疫苗注射动物后应产生破伤风抗体（通则3504）；（2）疫苗加入枸椽酸钠或碳酸钠将吸附剂溶解后做絮状试验（通则3506），应出现絮状反应；（3）疫苗经解聚液溶解佐剂后取上清液，做凝胶免疫沉淀试验（通则3403），出现免疫沉淀反应。

　　3.2.2  物理检查

　　3.2.2.1  外观

　　振摇后应呈均匀乳白色混悬液，无摇不散的凝块或异物。

　　3.2.2.2  装量

　　依法检查（通则0102），应不低于标示量。

　　3.2.2.3  渗透压摩尔浓度

　　依法测定（通则0632），应符合批准的要求。

　　3.2.3  化学检定

　　3.2.3.1  pH值

　　应为5.8~7.2（通则0631）。

　　3.2.3.2  铝含量

　　应为0.17~0.26mg/剂（通则3106）。

　　3.2.3.3  硫柳汞含量

　　应不高于0.05mg/剂（通则3115）。

　　3.2.3.4  游离甲醛含量

　　应不高于0.1mg/剂（通则3207第一法）。

　　3.2.3.5  戊二醛含量

　　应小于0.005mg/剂（通则3204）。

　　3.2.4  效价测定

　　3.2.4.1  无细胞百日咳疫苗

　　按“吸附百白破联合疫苗”中附录2进行。以适宜的稀释倍数稀释至第一个免疫剂量，再按5倍系列稀释。免疫时间为21天。每1次人用剂量的免疫效价应不低于4.0IU，且95%可信限的低限应不低于2.0IU。如达不到上述要求时可进行复试，但所有的有效试验结果必须以几何平均值（如用概率分析法时，应用加权几何平均）来计算。达到上述要求即判为合格。

　　3.2.4.2  白喉疫苗

　　每1次人用剂量中白喉类毒素的免疫效价应不低于30IU（通则3505）。

　　3.2.4.3  破伤风疫苗

　　每1次人用剂量中破伤风类毒素的免疫效价应不低于40IU（通则3504）。

　　3.2.5  无菌检查

　　依法检查（通则1101），应符合规定。

　　3.2.6  特异性毒性检查

　　3.2.6.1  无细胞百日咳疫苗

　　按本品种附录中2.5项进行。

　　3.2.6.2  白喉、破伤风疫苗

　　用体重250~350g豚鼠，每批制品不少于4只，每只腹部皮下注射2.5ml，分两侧注射，每侧1.25ml，观察30天。注射部位可有浸润，经5~10天变成硬结，可能30天不完全吸收。在第10天、第20天、第30天称体重，到期体重比注射前增加，局部无化脓、无坏死、无破伤风症状及无晚期麻痹症者为合格。

　　3.2.7  毒性逆转试验

　　每批供试品置37℃ 4周，按本品种附录中2.6项进行。

　　3.2.8  细菌内毒素检查

　　每1次人用剂量应不高于100EU（通则1143）。

于2~8℃避光保存和运输。自生产之日起，有效期为24个月；自百日咳原液脱毒之日起，疫苗总有效期不得超过36个月。

无细胞百日咳疫苗原液制造及检定要求。

应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定和批准的内容。

附录  无细胞百日咳疫苗原液制造及检定要求

　　本品系由百日咳杆菌的培养物或其上清液，经硫酸铵盐析和蔗糖密度梯度离心法提取百日咳毒素（PT）和丝状血凝素（FHA）等有效组分，经脱毒制成。用于制备吸附无细胞百白破联合疫苗。

　　1  制造

　　1.1  菌种

　　生产用菌种应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理及质量控制”的有关规定。

　　1.1.1  名称及来源

　　生产用菌种应采用百日咳I相CMCC 58003（CS株）或其他适宜菌株。

　　1.1.2  种子批的建立

　　应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理及质量控制”的规定。

　　1.1.3  种子批的传代

　　工作种子批菌种启开后传代不应超过10代用于生产。

　　1.1.4  种子批的检定

　　1.1.4.1  培养特性

　　于包-姜（Bordet-Gengou）培养基或其他适宜培养基上培养，各菌株应具有典型的形态，葡萄糖、尿素酶、硝酸盐、枸椽酸盐、半固体（动力）营养琼脂结果均应为阴性。

　　1.1.4.2  血清学试验

　　取经35~37℃培养40~48小时的菌苔，混悬于0.85%~0.90%氯化钠溶液或PBS内，制成适宜浓度的菌悬液，与I相参考血清做定量凝集反应，凝集效价应达到血清原效价之半。并同时进行Fim2、Fim3的血清学检测，应为阳性。

　　1.1.4.3  皮肤坏死试验

　　取经35~37℃培养40~48小时的菌苔，混悬于PBS内，并稀释成不同浓度的菌液；取家兔或豚鼠至少2只，分别用每一稀释度的菌液皮内注射0.1ml，经72小时观察注射部位的皮肤反应，其中至少1只家兔或豚鼠在注射含菌4.0×107以下稀释度的部位出现出血性坏死者，为阳性反应，判为合格。

　　1.1.4.4  毒力试验

　　用体重16~18g的小鼠至少3组，每组至少10只，在麻醉状态下从鼻腔滴入经培养20~24小时、以PBS稀释的菌液0.05ml，观察14天，记录小鼠生死情况，按Reed-Muench法计算LD50，1LD50的菌数应不高于1.2×108。

　　1.1.4.5  效价测定

　　按“吸附百白破联合疫苗”附录2进行。

　　1.1.5  菌种保存  

　　种子批应冻干保存于8℃及以下。

　　1.2  原液

　　1.2.1  生产用种子

　　将工作种子批菌种启开后，接种于改良包-姜培养基或活性炭半综合培养基或其他适宜培养基上，于35~37℃培养不超过72小时，以后各代不超过48小时。传代菌种保存不得超过14天，工作种子批启开后用于生产时不应超过10代。

　　1.2.2  生产用培养基

　　应选用S-S（Stainer-Scholte）培养基或其他适宜培养基。

　　1.2.3  培养

　　可采用静置培养法或发酵罐培养法，培养过程应取样做纯菌检查。

　　1.2.4  收获和杀菌

　　培养物于对数生长期后期或静止期前期收获。在培养物中加入硫柳汞杀菌。

　　1.2.5  纯化

　　采用硫酸铵盐析和蔗糖密度梯度离心，收集PT、FHA有效组分。

　　1.2.6  蛋白氮含量测定

　　依法测定（通则0731第二法）。

　　1.2.7  纯度测定

　　采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法或SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法检测，应显示主要含有PT和FHA两种组分，且批间比例应保持一致。PT和FHA等有效组分应不低于总蛋白质含量的85%。

　　1.2.8  脱毒和匀化

　　采用甲醛溶液或戊二醛溶液脱毒，然后用适宜方法除去脱毒剂，再经超声波匀化处理即为原液。

　　2  检定

　　2.1  染色镜检

　　取供试品的沉淀物，涂片染色镜检，不应有百日咳杆菌和其他细菌。

　　2.2  效价测定

　　按“吸附百白破联合疫苗”附录2进行。即先将原液稀释至成品的浓度后，以适宜的稀释倍数为第一个免疫剂量，再按5倍系列稀释，免疫21天后攻击。

　　2.3  无菌检查

　　依法检查（通则1101），应符合规定。

　　2.4  不耐热毒素试验

　　用0.85%~0.90%氯化钠溶液将供试品稀释至半成品浓度的2倍，用48~72小时龄的乳鼠至少4只，每只皮内注射0.025ml，或用体重2.5kg的家兔至少2只，每只皮内注射0.1ml，观察4日，受试动物不得出现不耐热毒素引起的任何局部反应。

　　2.5  特异性毒性检查

　　毒性参考品按照每批标示进行稀释，将供试品稀释至与成品相同浓度。用体重14~16g NIH小鼠（雌性或雌雄各半），毒性参考品的每一稀释度和供试品各用一组，每组至少10只。每只小鼠腹腔注射0.5ml，分别进行2.5.1~2.5.3项试验。

　　2.5.1  小鼠白细胞增多试验

　　于注射后3天分别取小鼠末梢血进行白细胞计数。试验结果经统计学方法处理后，注射供试品的小鼠白细胞增多毒性的活性应不高于0.5LPU/ml。

　　2.5.2  小鼠组胺致敏试验

　　于注射后4天，每只小鼠腹腔注射0.5ml溶液（含二盐酸组胺4mg或二磷酸组胺2mg），30分钟后分别测小鼠肛温。试验结果经统计学方法处理后，供试品的小鼠组胺致敏毒性的活性应不高于0.8HSU/ml，且无动物死亡。

　　2.6  毒性逆转试验

　　每批供试品置37℃ 4周，然后按2.5.2项进行试验。

　　2.7  热原检查

　　用0.85%~0.90%氯化钠溶液将供试品稀释成半成品浓度的1/50，依法检查（通则1142），注射剂量按家兔体重每1kg注射1ml，应符合规定。

　　3  保存、运输及有效期

　　于2~8℃避光保存和运输。自原液脱毒之日起，疫苗总有效期为36个月。

中华人民共和国药典：2020年版.三部/国家药典委员会编. —北京：中国医药科技出版社，2020.5 ISBN 978-7-5214-1575-9