Pishang Huahenyong Shuyi Huoyimiao

Plague Vaccine (Live) for Percutaneous Scarification

本品系用鼠疫杆菌的弱毒菌株经培养后收集菌体，加入稳定剂冻干制成。用于预防鼠疫。

生产和检定用设施、原材料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”的有关要求。

2.1  菌种

　　生产用菌种应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理及质量控制”的有关规定。

　　2.1.1  名称及来源

　　采用鼠疫杆菌弱毒菌株EV株。

　　2.1.2  种子批的建立

　　应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理及质量控制”的有关规定。

　　2.1.3  种子批的传代

　　工作种子批菌种启开至疫苗生产，传代应不超过3代。

　　2.1.4  种子批的检定

　　2.1.4.1  培养特性

　　在琼脂平皿上，35~37℃培养44~48小时之菌落应为粗糙型，在肉汤培养基的液面有薄菌膜，管底有沉淀物，肉汤透明。

　　2.1.4.2  染色镜检

　　应为革兰氏阴性杆菌。

　　2.1.4.3  生化反应

　　发酵葡萄糖，产酸不产气；石蕊牛乳轻度变红；在甘油培养基内不产酸不产气（通则3605）。

　　2.1.4.4  噬菌体裂解试验

　　将EV菌种涂于琼脂平皿上，加入106以上的鼠疫噬菌体1滴，于28℃培养44~48小时，噬菌体流过处应无本菌生长。

　　2.1.4.5  特异性毒性试验

　　选用体重300~400g豚鼠3只，每只皮下注射含菌1.2×10¹⁰（于28~30℃培养44~48小时）的培养物。在注射后第6天解剖1只，第21天解剖2只。肉眼检查注射部位、脾、肝和肺，并用脾、肝、肺及心血进行培养，其中心血和肺经培养应无本菌生长。肉眼检查病变，注射部位可见充血，浸润变为脓疡，肝和脾可有丘疹状结节，肺部不应有鼠疫特异病变为合格。肺部如有显著病变时，应用同数量豚鼠复试，若仍有显著病变时，菌种应废弃。

　　2.1.4.6  免疫力试验

　　选用体重200~250g的豚鼠10只，每只皮下注射含菌7.0×10⁵（于28~30℃培养44~48小时）的培养物，于20~25天后进行攻击，每只皮下感染鼠疫强毒菌200MLD。同时用3组豚鼠作对照，每组3只，各组豚鼠分别皮下注射0.5MLD、1MLD及2MLD的毒菌。免疫组及对照组至少观察25天。免疫动物存活不少于8只；而对照动物注射0.5MLD部分死亡，注射1MLD或2MLD全部死亡时，免疫力试验为合格。

　　2.1.5  种子批的保存

　　种子批应冻干保存于8℃及以下。

　　2.2  原液

　　2.2.1  生产用种子

　　2.2.1.1  第1代菌种

　　开启工作种子批菌种后，接种于经批准的培养基上培养，保存于2~8℃的第1代菌株可使用15天。

　　2.2.1.2  第2代菌种

　　将第1代菌种接种足够量的种子瓶制备第2代种子，培养物应进行纯菌检查。

　　2.2.1.3  第3代菌种

　　在第2代菌种不够的情况下，可用第2代种子制备第3代种子，并进行纯菌检查。

　　2.2.2  生产用培养基

　　采用厚金格尔琼脂培养基（pH6.8~7.2）或经批准的其他培养基。

　　2.2.3  接种和培养

　　将第2代或第3代生产用种子接种在生产用培养基上培养，逐瓶检查，有杂菌者废弃。

　　2.2.4  收获

　　用由蔗糖、明胶、硫脲、谷氨酸钠及尿素组成的稳定剂洗下菌苔（洗菌前弃去凝固水）或将菌苔刮入上述稳定剂内即为收获液，收获液进行纯菌检查，合格者合并制成原液。收获液和原液置2~8℃保存。

　　2.2.5  原液检定

　　按3.1项进行。

　　2.3  半成品

　　2.3.1  配制

　　根据3.1.2项测定的原液浓度，用稳定剂稀释至每1ml含菌1.6×10¹⁰。

　　2.3.2  半成品检定

　　按3.2项进行。

　　2.4  成品

　　2.4.1  分批

　　应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定。

　　2.4.2  分装与冻干

　　应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定。分装后应立即冻干，可真空封口，亦可充氮封口。

　　2.4.3  规格

　　按标示量复溶后每瓶0.5ml（10次人用剂量），含菌8.0×10⁹；按标示量复溶后每瓶1.0ml（20次人用剂量），含菌1.6×10¹⁰。每1次人用剂量含活菌数应不低于2.0×10⁸。

　　2.4.4  包装

　　应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定。

3.1  原液检定

　　3.1.1  纯菌检查

　　按通则1101方法做纯菌检查，生长物做涂片镜检，应符合鼠疫EV菌株特征，不得有杂菌。

　　3.1.2  浓度测定

　　用国家药品检定机构分发的浓度测定用参考品，以分光光度法或其他方法测定浓度。

　　3.2  半成品检定

　　纯菌检查

　　按3.1.1项进行。

　　3.3  成品检定

　　除装量差异和水分测定外，按标示量加入氯化钠注射液复溶后，进行其余各项检定。

　　3.3.1  鉴别试验

　　按2.1.4.4项进行。

　　3.3.2  物理检查

　　3.3.2.1  外观

　　应为白色或淡黄色疏松体，按标示量加入0.85%~0.90%氯化钠溶液后，应在半分钟内复溶，并呈均匀悬液。

　　3.3.2.2  装量差异

　　依法检查（通则0102），应符合规定。

　　3.3.3  水分

　　应不高于3.0%（通则0832）。

　　3.3.4  纯菌检查

　　3.3.4.1  按3.1.1项进行。

　　3.3.4.2  噬菌体裂解试验

　　取一支待检疫苗，加入0.5ml 0.85%~0.90%氯化钠溶液复溶，取复溶菌液120μl与120μl鼠疫噬菌体在1.5ml EP管中混合，接种2个营养琼脂培养基平皿，每个平皿接种100μl。用L型玻璃棒均匀涂抹后分别置20~25℃、30~35℃培养观察44~48小时，无杂菌生长判为合格。

　　3.3.5  菌落和菌形检查

　　应呈典型粗糙型菌落，涂片染色镜检，为革兰氏阴性杆菌。

　　3.3.6  浓度测定

　　用国家药品检定机构分发的浓度测定用参考品，以分光光度法测定，每1次人用剂量含菌数不高于9.5×10⁸。

　　3.3.7  活菌数测定

　　取本品3瓶，混匀并稀释至菌数为1.0×10³/ml，接种5个平皿，每个平皿接种0.1ml。均匀涂抹后置28~30℃培养2~3天。每1次人用剂量含活菌数应不低于2.0×10⁸。

　　3.3.8  效力测定

　　取每5批疫苗中的首批进行效力测定。用体重250~300g豚鼠10只，每只皮下注射含菌5.0×10⁷，注射后20~25天以200MLD的鼠疫毒菌进行皮下攻击。同时有3组豚鼠作对照，每组3只，分别于各组豚鼠皮下注射0.5MLD、1MLD和2MLD。各组动物于注射后，观察25天。免疫动物存活不少于8只；而对照组动物注射0.5MLD部分死亡，注射1MLD或2MLD全部死亡时，效力测定为合格。

　　3.3.9  特异性毒性检查

　　取体重250~350g豚鼠2只，每只皮下注射含菌1.2×10¹⁰的本品，第6天称体重，体重减轻应不超过20%，并取其中1只解剖，另1只观察到21天解剖。检查项目及要求同2.1.4.5项。

稀释剂为氯化钠注射液，稀释剂的生产应符合批准的要求，氯化钠注射液应符合本版药典（二部）的相关规定。

于2~8℃避光保存和运输。自生产之日起，有效期为12个月。

应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定和批准的内容。

中华人民共和国药典：2020年版.三部/国家药典委员会编. —北京：中国医药科技出版社，2020.5 ISBN 978-7-5214-1575-9