Pishang Huahen Renyong Bushijun Huoyimiao

Brucellosis Vaccine (Live) for Percutaneous Scarification

本品系用布氏菌的弱毒菌株经培养、收集菌体加入稳定剂后冻干制成。用于预防布氏菌病。

生产和检定用设施、原材料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”的有关要求。

2.1  菌种

　　生产用菌种应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理及质量控制”的有关规定。

　　2.1.1  名称及来源

　　采用牛布氏菌的弱毒菌株104M株。

　　2.1.2  种子批的建立

　　应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理及质量控制”的有关规定。

　　禁止使用通过动物传代后再分离之菌株制造疫苗。

　　2.1.3  种子批的传代

　　工作种子批启开后至疫苗生产，传代应不超过3代。

　　2.1.4  种子批的检定

　　2.1.4.1  培养特性

　　在含有1:50 000碱性品红培养基应生长，但在含同浓度的硫堇培养基应不生长（亦可用纸片法检查），在肝琼脂斜面培养基产生微量硫化氢。

　　2.1.4.2  染色镜检

　　应为革兰氏阴性球杆菌。

　　2.1.4.3  变异检查

　　用0.85%~0.90%氯化钠溶液将新鲜培养物制成含菌2.5×10⁹~3.0×10⁹/ml的菌悬液，置90℃水浴中30分钟，不应出现凝集现象。用同浓度的菌悬液与1:1000三胜黄素水溶液等量混合，于37℃放置24小时，不应出现凝集现象。用结晶紫染色检查菌落，菌落变异率不高于3%。

　　2.1.4.4  噬菌体裂解试验

　　将菌种接种于肝琼脂平皿，加入布氏菌Tb噬菌体1滴，于35~37℃培养44~48小时，噬菌体流过处应无本菌生长。

　　2.1.4.5  血清学试验

　　用0.85%~0.90%氯化钠溶液将新鲜培养物制成含菌5.0×10⁹/ml的菌悬液，与布氏菌参考血清做凝集反应，其凝集效价应达到血清原效价。

　　2.1.4.6  残余毒力检查

　　用0.85%~0.90%氯化钠溶液将35~37℃培养44~48小时之肝琼脂斜面新鲜培养物制成菌悬液，并稀释成含菌1.5×10⁹/ml、3.0×10⁹/ml、6.0×10⁹/ml、1.2×10¹⁰/ml和2.4×10¹⁰/ml等5个浓度的菌悬液。取体重18~20g小鼠25只分为5组，各组分别用不同浓度的菌悬液腹腔注射，每只0.5ml，观察7天，计算LD50，应为1.0×10⁹~6.0×10⁹个菌。

　　2.1.4.7  免疫力试验

　　每3~5年至少做一次免疫力试验。用0.85%~0.90%氯化钠溶液将菌种第1代新鲜培养物制成2.0×10⁸/ml的菌悬液。取体重300~350g豚鼠10只，每只皮下注射1ml，经25~30天后，每只豚鼠皮下攻击羊型强毒布氏菌10个或20个感染量（MID）。同时取3只豚鼠作对照，皮下注射1MID。免疫及对照豚鼠于注射毒菌悬液后均观察25~30天后解剖，取出鼠腹股沟淋巴结、腹主动脉旁淋巴结、肝及脾，分别接种肝琼脂中管斜面培养基，于35~37℃培养10天。如免疫动物组织之培养物有布氏菌生长，应用硫堇培养基（亦可用纸片法）和硫化氢反应做菌型鉴别试验。对照组3只豚鼠都必须发生全身感染，即肝脏或脾脏应分离出羊型毒菌。免疫组攻击10MID时，10只豚鼠中不应有2只以上分离出羊型毒菌；攻击20MID时，10只豚鼠中不应有3只以上分离出羊型毒菌。

　　2.1.5  种子批的保存

　　种子批应冻干保存于8℃及以下。

　　2.2  原液

　　2.2.1  生产用种子

　　2.2.1.1  将工作种子批菌种启开后，接种在肝琼脂斜面或其他适宜培养基上进行第1代培养。第1代菌种须进行1:500三胜黄素玻片凝集试验，只有光滑型菌方可用于疫苗生产。第1代菌种斜面于2~8℃可保存15天。

　　2.2.1.2  将菌种接种到适宜的培养基上培养，培养物经纯菌检查合格后，弃去凝固水，用无菌0.85%~0.90%氯化钠溶液制成菌悬液。由此制备适宜数量的生产用种子。

　　2.2.2  生产用培养基

　　采用适宜pH值的肝琼脂或经批准的其他培养基。

　　2.2.3  菌种接种和培养

　　将第2代或第3代生产用种子接种在生产用培养基上培养，肉眼逐瓶检查，有杂菌者应废弃。

　　2.2.4  收获

　　用含有蔗糖、明胶、硫脲和谷氨酸钠的稳定剂或其他适宜的稳定剂洗下菌苔或刮取菌苔于稳定剂内即为收获液，收获液进行纯菌检查，合格者合并制成原液。收获液和原液置2~8℃保存。

　　2.2.5  原液检定

　　按3.1项进行。

　　2.3  半成品

　　2.3.1  配制

　　将原液稀释成每1ml含菌1.9×10¹¹。由细菌收获到冻干不得超过7天。

　　2.3.2  半成品检定

　　按3.2项进行。

　　2.4  成品

　　2.4.1  分批

　　应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定。

　　2.4.2  分装与冻干

　　应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定。分装后应立即进行冻干，真空封口，亦可充氮封口。

　　2.4.3  规格

　　按标示量复溶后每瓶0.5ml（10次人用剂量），含菌9.5×10¹⁰。每1次人用剂量含活菌数应不低于3.0×10⁹。

　　2.4.4  包装

　　应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定。

3.1  原液检定

　　3.1.1  纯菌检查

　　按通则1101方法做纯菌检查，生长物做涂片镜检，不得有杂菌。

　　3.1.2  浓度测定

　　用国家药品检定机构分发的浓度测定用参考品，以分光光度法或其他方法测定浓度。

　　3.2  半成品检定

　　纯菌检查

　　按3.1项进行。

　　3.3  成品检定

　　除装量差异和水分测定外，按标示量加入氯化钠注射液，复溶后进行其余各项检定。

　　3.3.1  鉴别试验

　　用特异血清做凝集试验，应出现明显凝集反应，或按2.1.4.4项进行。

　　3.3.2  物理检查

　　3.3.2.1  外观

　　应为乳白色疏松体。按标示量加入0.85%~0.90%氯化钠溶液后应于1分钟内复溶，并呈均匀悬液。

　　3.3.2.2  装量差异

　　依法检查（通则0102），应符合规定。

　　3.3.3  水分

　　应不高于3.0%（通则0832）。

　　3.3.4  纯菌检查

　　按3.1项进行。

　　3.3.5  菌型检查

　　每亚批疫苗应用硫堇培养基（或纸片法）及硫化氢反应做菌型鉴别检查，应呈牛布氏菌的培养特性。

　　3.3.6  浓度测定

　　用国家药品检定机构分发的浓度测定用参考品，以分光光度法测定浓度，每1次人用剂量应含菌数不高于1.1×10¹⁰。

　　3.3.7  活菌数测定及菌落变异检查

　　每亚批取3瓶，加0.85%~0.90%氯化钠溶液复溶混匀后比浊。将菌液浓度稀释为含菌1.0×10³/ml，接种5个平皿，每个平皿接种0.1ml。用涂菌棒涂匀后置35~37℃培养4~5天，计算活菌数，每1次人用剂量含活菌数应不低于3.0×10⁹；同时用结晶紫染色检查菌落，菌落变异率不得超过10%。

　　3.3.8  效力测定

　　取每5批疫苗中的首批进行效力测定。将复溶后的本品用无菌0.85%~0.90%氯化钠溶液稀释成含菌5.0×10⁸/ml菌悬液。取体重300~350g豚鼠10只，每只皮下注射1ml。经25~30天后，每只豚鼠皮下攻击羊型强毒布氏菌10MID或20MID。同时用3只豚鼠作对照，于皮下注射1MID。各组动物于注射毒菌悬液后25~30天解剖，取鼠腹股沟淋巴结、腹主动脉旁淋巴结、肝及脾，分别接种肝琼脂中管斜面培养基，于37℃培养10天。如免疫动物组织之培养物有布氏菌生长，需用硫堇培养基（亦可用纸片法）和硫化氢反应做菌型鉴别试验。对照组3只豚鼠都必须发生全身感染，即肝脏或脾脏应分离出羊型毒菌。攻击10MID时，10只免疫豚鼠中不应有3只以上分离出羊型毒菌；攻击20MID时，10只免疫豚鼠中不应有4只以上分离岀羊型毒菌。

　　3.3.9  特异性毒性试验

　　每亚批取3瓶，用体重18~20g小鼠5只，每只皮下注射含菌1.0×10⁹/ml的菌悬液0.5ml。观察7天不应有死亡，如有死亡应复试一次，仍有死亡，为不合格。

稀释剂为氯化钠注射液，稀释剂的生产应符合批准的要求，氯化钠注射液应符合本版药典（二部）的相关规定。

于2~8℃避光保存和运输。自生产之日起，有效期为12个月。

应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定和批准的内容。

中华人民共和国药典：2020年版.三部/国家药典委员会编. —北京：中国医药科技出版社，2020.5 ISBN 978-7-5214-1575-9