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森林脑炎灭活疫苗
Senlinnaoyan Miehuoyimiao
Tick-borne Encephalitis Vaccine, Inactivated
本品系用森林脑炎病毒接种原代地鼠肾细胞，经培养、病毒收获、灭活、纯化后，加入稳定剂和氢氧化铝佐剂制成。用于预防森林脑炎。
生产和检定用设施、原材料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”的有关要求。
2.1 生产用细胞
生产用细胞为原代地鼠肾细胞。
2.1.1 细胞管理及检定
应符合“生物制品生产检定用动物细胞基质制备及质量控制”规定。
2.1.2 细胞制备
选用10~14日龄地鼠，无菌取肾，剪碎，经胰蛋白酶消化，用培养液分散细胞，制备细胞悬液，置适宜温度下培养成致密单层细胞。来源于同一批地鼠、同一容器内消化制备的地鼠肾细胞为一个细胞消化批；源自同一批地鼠、于同一天制备的多个细胞消化批为一个细胞批。
2.2 毒种
2.2.1 名称及来源
生产用毒种为分离自森林脑炎患者脑组织的“森张”株。
2.2.2 种子批的建立
应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理及质量控制”规定。
“森张”株原始种子应不超过第3代；主种子批应不超过第6代；工作种子批应不超过第10代。
2.2.3 种子批毒种的检定
主种子批应进行以下全面检定，工作种子批应至少进行2.2.3.1~2.2.3.6项检定。
2.2.3.1 鉴别试验
采用小鼠脑内中和试验法。将毒种做10倍系列稀释，取10-3~10-6稀释度，每个稀释度加入等量的森林脑炎病毒特异性免疫血清作为试验组；取10-6~10-9稀释度，每个稀释度加入等量的稀释液作为对照组，试验组和对照组同时置37℃水浴30分钟，每个稀释度分别脑内接种7~9g小鼠10只，每只0.03ml；3天内死亡者不计（动物死亡数量应不得超过试验动物总数的20%），逐日观察14天。中和指数应不低于500。
2.2.3.2 病毒滴定
采用小鼠脑内滴定法。将毒种做10倍系列稀释，取适宜稀释度，每个稀释度脑内接种7~9g小鼠6只，每只0.03ml，3天内死亡者不计（动物死亡数量应不得超过试验动物总数的20%），逐日观察14天。病毒滴度应不低于9.0 lg LD50/ml。
2.2.3.3 无菌检查
依法检查（通则1101），应符合规定。
2.2.3.4 分枝杆菌检查
以草分枝杆菌（CMCC 95024）或牛分枝杆菌菌株BCG作为阳性对照菌。取阳性对照菌接种于罗氏固体培养基，于37℃培养3~5天收集培养物，以0.85%~0.90%氯化钠溶液制成菌悬液，釆用细菌浊度法确定菌含量，该菌液浊度与中国细菌浊度标准一致时活菌量约为2×107CFU/ml。稀释菌悬液，取不高于100CFU的菌液作为阳性对照。
供试品小于1ml时采用直接接种法，将供试品全部接种于适宜固体培养基（如罗氏培养基或Middlebrook 7H10培养基），每种培养基做3个重复；并同时设置阳性对照。将接种后的培养基置于37℃培养56天，阳性对照应有菌生长，接种供试品的培养基未见分枝杆菌生长，则判为合格。
供试品大于1ml时釆用薄膜过滤法集菌后接种培养基。将供试品以0.22μm滤膜过滤后，取滤膜接种于适宜固体培养基，同时设阳性对照。所用培养基、培养时间及结果判定同上。
2.2.3.5 支原体检查
依法检查（通则3301），应符合规定。
2.2.3.6 外源病毒因子检查
依法检查（通则3302），应符合规定。
2.2.3.7 免疫原性检查
取主种子批毒种制备疫苗，免疫10~12g小鼠35只作为试验组，每只腹腔注射0.3ml，同时设未经免疫小鼠30只作为对照组。分别于第1天、第3天、第5天免疫，于第10天用“森张”株病毒进行腹腔攻击，每只腹腔注射0.3ml。试验组的病毒稀释度取10-2~10-6，对照组的病毒稀释度取10-6~10-10，每个病毒稀释度分别攻击6只，攻击后3天内死亡者不计（动物死亡数量应不得超过试验动物总数的20%），观察21天判定结果。对照组病毒滴度应不低于7.5 lg LD50/0.3ml，毒种的免疫保护指数应大于105。
2.2.4 毒种保存
冻干毒种应于-20℃以下保存；鼠脑毒种和液体毒种应于-60℃以下保存。
2.3 原液
2.3.1 细胞制备
按2.1.2项进行。
2.3.2 培养液
釆用适宜的培养液进行培养。如培养液含新生牛血清，其质量应符合要求（通则3604）。
2.3.3 对照细胞外源病毒因子检查
依法检查（通则3302），应符合规定。
2.3.4 病毒接种和培养
选择细胞生长良好的细胞瓶，接种病毒进行培养。病毒接种量及培养条件按批准的执行。
2.3.5 病毒收获
选择有典型细胞病变的培养瓶，进行病毒收获。根据细胞生长情况，可换以维持液继续培养，检定合格的同一细胞批生产的同一次病毒收获液可合并为单次病毒收获液。
2.3.6 单次病毒收获液保存
于2~8℃保存不超过90天。
2.3.7 病毒灭活
各单次病毒收获液加入甲醛灭活病毒，具体工艺参数，包括收获液蛋白质含量和甲醛浓度等按批准的执行。病毒灭活到期后，每个病毒灭活容器应立即取样，分别进行病毒灭活验证试验。
2.3.8 病毒灭活验证试验
取灭活后病毒液接种12~14g小鼠8只，每只脑内接种0.03ml，同时每只腹腔接种0.5ml，为第1代；接种后第7天将第1代小鼠处死3只，取脑后制成10%悬液，脑内接种6只小鼠，为第2代；接种后第7天将第2代小鼠处死3只，取脑后制成10%悬液，同法脑内接种6只小鼠，为第3代；每代小鼠自接种之日起，接种后3天内死亡者不计（动物死亡数量应不得超过试验动物总数的20%），逐日观察14天，动物应全部健存。
2.3.9 合并、离心、超滤浓缩
同一细胞批生产的单次病毒收获液经病毒灭活后可进行合并。合并的病毒收获液经离心后，进行适宜倍数的超滤浓缩至规定的蛋白质含量范围。
2.3.10 纯化
采用柱色谱法将超滤浓缩后的病毒液进行纯化。
2.3.11 除菌过滤
纯化后的病毒液经除菌过滤后，即为原液。
2.3.12 原液检定
按3.2项进行。
2.4 半成品
2.4.1 配制
将原液按抗原含量为1:16进行配制，且蛋白质含量应不高于40μg/ml，加入适宜稳定剂、适量的氢氧化铝佐剂和硫柳汞抑菌剂，即为半成品。
2.4.2 半成品检定
按3.3项进行。
2.5 成品
2.5.1 分批
应符合“生物制品分包装及贮运管理”。
2.5.2 分装
应符合“生物制品分包装及贮运管理”。
2.5.3 规格
每瓶1.0ml。每1次人用剂量为1.0ml。
2.5.4 包装
应符合“生物制品分包装及贮运管理”。
3.1 单次病毒收获液检定
3.1.1 病毒滴定
按2.2.3.2项进行，病毒滴度应不低于7.0 lg LD50/ml。
3.1.2 无菌检查
依法检查（通则1101），应符合规定。
3.1.3 支原体检查
依法检查（通则3301），应符合规定。
3.2 原液检定
3.2.1 无菌检查
依法检查（通则1101），应符合规定。
3.2.2 抗原含量
采用酶联免疫吸附法（通则3429），应不低于1:32。
3.2.3 蛋白质含量
应不高于80μg/ml（通则0731第二法）。
3.2.4 牛血清白蛋白残留量
应不高于50ng/ml（通则3411）。
3.2.5 地鼠肾细胞蛋白质残留量
釆用酶联免疫吸附法（通则3429），应不高于12μg/ml。
3.3 半成品检定
无菌检查
依法检查（通则1101），应符合规定。
3.4 成品检定
3.4.1 鉴别试验
按3.4.6项进行，应符合规定。效价测定不合格，鉴别试验不成立。
3.4.2 外观
应为微乳白色混悬液体，久置形成可摇散的沉淀，无异物。
3.4.3 装量
依法检查（通则0102），应不低于标示量。
3.4.4 渗透压摩尔浓度
依法检查（通则0632），应符合批准的要求。
3.4.5 化学检定
3.4.5.1 pH值
应为7.2~8.0（通则0631）。
3.4.5.2 游离甲醛含量
应不高于100μg/ml（通则3207第一法）。
3.4.5.3 硫柳汞含量
应不高于70μg/ml（通则3115）。
3.4.5.4 铝含量
应不高于0.24mg/ml（通则3106）。
3.4.6 效价测定
将供试品腹腔免疫体重10~12g小鼠30只，免疫2次，间隔7天，每只小鼠每次腹腔注射0.3ml。另取同批小鼠30只作为空白对照。初次免疫后第14天以适宜稀释度的“森张”株病毒悬液分别进行小鼠腹腔攻击，每个病毒稀释度分别攻击6只，每只0.3ml，攻击后3天内死亡者不计（动物死亡数量应不得超过试验动物总数的20%），观察21天判定结果。对照组病毒滴度应不低于7.5 lg LD50/0.3ml，免疫保护指数应大于5.0×105。
3.4.7 热稳定性试验
应由生产单位在成品入库前取样测定。于37℃放置7天后，按3.4.6项进行效价测定。如合格，视为效价测定合格。
3.4.8 抗生素残留量
生产过程中加入抗生素的应进行该项检查。采用酶联免疫吸附法（通则3429），应不高于50ng/剂。
3.4.9 无菌检查
依法检查（通则1101），应符合规定。
3.4.10 异常毒性检查
依法检查（通则1141），应符合规定。
3.4.11 细菌内毒素检查
应不高于100EU/ml（通则1143凝胶限度试验）。
于2~8℃避光保存和运输。自生产之日起，有效期为21个月。
应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定和批准的内容。
中华人民共和国药典：2020年版.三部/国家药典委员会编. —北京：中国医药科技出版社，2020.5 ISBN 978-7-5214-1575-9
