Shuangjia Shenzonghezheng Chuxuere Miehuoyimiao (Dishushen Xibao)

Haemorrhagic Fever with Renal Syndrome Bivalent Vaccine (Hamster Kidney Cell), Inactivated

本品系用I型和II型肾综合征出血热（简称出血热）病毒分别接种原代地鼠肾细胞，经培养、收获病毒液，病毒灭活、纯化，混合后加入氢氧化铝佐剂制成。用于预防I型和II型肾综合征出血热。

生产和检定用设施、原材料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”的有关要求。

2.1  生产用细胞

　　生产用细胞为原代地鼠肾细胞。

　　2.1.1  细胞管理及检定

　　应符合“生物制品生产检定用动物细胞基质制备及质量控制”规定。

　　2.1.2  细胞制备

　　选用12~14日龄的地鼠，无菌取肾，剪碎，经消化，用培养液分散细胞，制备成细胞悬液，置适宜温度下培养成致密单层细胞。来源于同一批地鼠、同一容器内消化制备的地鼠肾细胞为一个细胞消化批；源自同一批地鼠、于同一天制备的多个细胞消化批为一个细胞批。

　　2.2  毒种

　　2.2.1  名称及来源

　　生产用毒株为I型出血热病毒PS-6株和II型出血热病毒L99株，或经批准的其他适应地鼠肾细胞的I型和II型出血热毒株。

　　2.2.2  种子批的建立

　　应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理及质量控制”规定。

　　I型和II型出血热病毒分别接种原代地鼠肾细胞制备原始种子、主种子批和工作种子批。PS-6株原始种子为第5代，主种子批应不超过第8代，工作种子批应不超过第10代，生产的疫苗应不超过第11代；L99株原始种子为第13代，主种子批L99株应不超过第16代，工作种子批应不超过第18代，生产的疫苗应不超过第19代。

　　2.2.3  种子批毒种的检定

　　主种子批应进行以下全面检定，工作种子批应至少进行2.2.3.1~2.2.3.5项检定。

　　2.2.3.1  鉴别试验

　　将各型毒种做10倍系列稀释，每个稀释度分别与已知相应型别的出血热病毒免疫血清参考品和阴性兔血清等量混合，置37℃水浴90分钟，接种于单层Vero-E6细胞或地鼠肾细胞，于适宜条件下培养，观察10~14天。以免疫荧光法测定，中和指数应大于1000。同时设病毒阳性对照、细胞阴性对照。

　　2.2.3.2  病毒滴定

　　将各型毒种做10倍系列稀释，接种地鼠肾细胞，于33℃培养10~12天，用免疫荧光法测定，主种子批病毒滴度应不低于7.5 lg CCID50/ml，工作种子批病毒滴度应不低于7.0 lg CCID50/ml。

　　2.2.3.3  无菌检查

　　依法检查（通则1101），应符合规定。

　　2.2.3.4  分枝杆菌检查

　　以草分枝杆菌（CMCC 95024）或牛分枝杆菌菌株BCG作为阳性对照菌。取阳性对照菌接种于罗氏固体培养基，于37℃培养3~5天收集培养物，以0.85%~0.90%氯化钠溶液制成菌悬液，采用细菌浊度法确定菌含量，该菌液浊度与中国细菌浊度标准一致时活菌量约为2×107CFU/ml。稀释菌悬液，取不高于100CFU的菌液作为阳性对照。

　　供试品小于1ml时釆用直接接种法，将供试品全部接种于适宜固体培养基（如罗氏培养基或Middlebrook 7H10培养基），每种培养基做3个重复；并同时设置阳性对照。将接种后的培养基置于37℃培养56天，阳性对照应有菌生长，接种供试品的培养基未见分枝杆菌生长，则判为合格。

　　供试品大于1ml时采用薄膜过滤法集菌后接种培养基。将供试品以0.22μm滤膜过滤后，取滤膜接种于适宜固体培养基，同时设阳性对照。所用培养基、培养时间及结果判定同上。

　　2.2.3.5  支原体检查

　　依法检查（通则3301），应符合规定。

　　2.2.3.6  外源病毒因子检查

　　依法检查（通则3302），应符合规定。

　　2.2.3.7  免疫原性检查

　　取主种子批毒种制备双价疫苗，接种体重为2kg左右的白色家兔4只（家兔出血热病毒抗体应为阴性），免疫2次，间隔14天。每只后肢肌内注射1.0ml。第1次免疫后4周采血分离血清，用蚀斑减少中和试验测中和抗体，中和用病毒为出血热病毒76-118株和UR株；同时用参考血清作对照（参考血清应符合规定），4只家兔的I型和II型出血热病毒中和抗体滴度均应不低于1:10。

　　2.2.4  毒种保存

　　种子批毒种应于-60℃以下保存。

　　2.3  单价原液

　　2.3.1  细胞制备

　　按2.1.2项进行。

　　2.3.2  培养液

　　采用适宜的培养液进行培养。如培养液含新生牛血清，其质量应符合要求（通则3604）。

　　2.3.3  对照细胞外源病毒因子检查

　　依法检查（通则3302），应符合规定。

　　2.3.4  病毒接种和培养

　　当细胞培养成致密单层后，将出血热病毒I型和II型毒种分别接种细胞进行培养，病毒接种量及培养条件按批准的执行。

　　2.3.5  病毒收获

　　培养适宜天数后，收获病毒液。根据细胞生长情况，可换以维持液继续培养，进行多次病毒收获。检定合格的同一细胞批生产的同一次病毒收获液可合并为单次病毒收获液。

　　2.3.6  单次病毒收获液保存

　　于2~8℃保存不超过30天。

　　2.3.7  病毒灭活

　　单次病毒收获液加入甲醛灭活病毒，具体工艺参数，包括收获液蛋白质含量和甲醛浓度等按批准的执行。病毒灭活到期后，每个病毒灭活容器应立即取样，分别进行病毒灭活验证试验。

　　2.3.8  病毒灭活验证试验

　　按灭活后的单次病毒收获液总量的0.1%抽取供试品。透析后接种地鼠肾细胞，连续盲传3代，每10~14天为1代，每代用免疫荧光法检查病毒抗原，结果均应为阴性。

　　2.3.9  合并、离心、超滤浓缩

　　检定合格的同一细胞批生产的单次病毒收获液可合并为单价病毒收获液。经离心去除细胞碎片后，进行适当倍数的超滤浓缩至规定的蛋白质含量范围。

　　2.3.10  纯化

　　采用柱色谱法或其他适宜的方法将浓缩后的单价病毒收获液进行纯化。

　　2.3.11  除菌过滤

　　纯化后的单价病毒收获液经除菌过滤后，即为单价病毒原液。

　　2.3.12  单价原液检定

　　按3.2项进行。

　　2.3.13  单价原液保存

　　于2~8℃保存不超过90天。

　　2.4  半成品

　　2.4.1  配制

　　将I型和II型出血热病毒单价原液分别按抗原含量为1:128稀释后等量混合，且各型总蛋白质含量应不超过40μg/剂，加入适宜稳定剂、适量的硫柳汞抑菌剂和氢氧化铝佐剂后，即为半成品。

　　2.4.2  半成品检定

　　按3.3项进行。

　　2.5  成品

　　2.5.1  分批

　　应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定。

　　2.5.2  分装

　　应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定。

　　2.5.3  规格

　　每瓶为1.0ml。每1次人用剂量为1.0ml。

　　2.5.4  包装

　　应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定。

3.1  单次病毒收获液检定

　　3.1.1  无菌检查

　　依法检查（通则1101），应符合规定。

　　3.1.2  支原体检查

　　依法检查（通则3301），应符合规定。

　　3.1.3  病毒滴定

　　按2.2.3.2项进行病毒滴定。各型单次病毒收获液的病毒滴度应不低于6.5 lg CCID50/ml。

　　3.1.4  抗原含量

　　采用酶联免疫吸附法（通则3429），应不低于1:64。

　　3.2  单价原液检定

　　3.2.1  无菌检查

　　依法检查（通则1101），应符合规定。

　　3.2.2  抗原含量

　　采用酶联免疫吸附法（通则3429），应不低于1:512。

　　3.2.3  蛋白质含量

　　应不高于80μg/ml（通则0731第二法）。

　　3.2.4  牛血清白蛋白残留量

　　应不高于50ng/ml（通则3411）。

　　3.2.5  地鼠肾细胞蛋白质残留量

　　采用酶联免疫吸附法（通则3429），应不高于12μg/剂。

　　3.3  半成品检定

　　无菌检查

　　依法检查（通则1101），应符合规定。

　　3.4  成品检定

　　3.4.1  鉴别试验

　　可选择下列方法进行鉴别试验。

　　3.4.1.1  效价测定

　　按2.2.3.7项进行，效力测定符合规定，鉴别试验判为合格。效价测定不合格，采用RT-PCR方法进行鉴别试验。

　　3.4.1.2  RT-PCR方法

　　可采用商业试剂盒进行，按试剂盒要求操作。阳性对照为I型和II型阳性质粒，空白对照为无菌（注射用）水。

　　引物序列为：

　　HTNF1：5'-ATAACAACGATGGCAACTATGGAG-3'；

　　HTNR1：5'-CTCATCTGGATCCTTTTCATATTGT-3'；

　　SEOF1：5'-GCACTGCATGATCGGGAGAGT-3'；

　　SEOR1：5'-ATCCTGTCGGCAAGTTGGC-3'。

　　探针序列为：

　　HTNP：5'-FAM-ATAGCCAGGCAGAAGG-MGB-3'；

　　SEOP：5'-HEX-TCGCAGCTTCAATACAA-MGB-3'。

　　样品、阳性对照和空白对照均重复3个孔进行试验。结果判定按试剂盒说明书进行，结果为阳性者，鉴别试验判为合格。

　　3.4.2  外观

　　应为微乳白色混悬液体，久置形成可摇散的沉淀，无异物。

　　3.4.3  装量

　　依法检查（通则0102），应不低于标示量。

　　3.4.4  渗透压摩尔浓度

　　依法检查（通则0632），应符合批准的要求。

　　3.4.5  化学检定

　　3.4.5.1  pH值

　　应为7.2~8.0（通则0631）。

　　3.4.5.2  硫柳汞含量

　　应不高于70μg/ml（通则3115）。

　　3.4.5.3  铝含量

　　应不高于0.24mg/ml（通则3106）。

　　3.4.5.4  游离甲醛含量

　　应不高于100μg/ml（通则3207第一法）。

　　3.4.6  效价测定

　　按2.2.3.7项进行。4只家兔的I型和II型岀血热病毒的中和抗体滴度均应不低于1:10。

　　3.4.7  热稳定性试验

　　应由生产单位在成品入库前取样测定。于37℃放置7天，按2.2.3.7项进行效价测定，如合格，视为效价测定合格。

　　3.4.8  抗生素残留量

　　生产过程中加入抗生素的应进行该项检查。采用酶联免疫吸附法（通则3429），应不高于50ng/剂。

　　3.4.9  无菌检查

　　依法检查（通则1101），应符合规定。

　　3.4.10  异常毒性检查

　　依法检查（通则1141），应符合规定。

　　3.4.11  细菌内毒素检查

　　应小于50EU/ml（通则1143凝胶限度试验）。

于2~8℃避光保存和运输。自生产之日起，有效期为18个月。

应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定和批准的内容。

中华人民共和国药典：2020年版.三部/国家药典委员会编. —北京：中国医药科技出版社，2020.5 ISBN 978-7-5214-1575-9