Jiaxing Ganyan Miehuoyimiao (Ren Erbeiti Xibao)

Hepatitis A Vaccine (Human Diploid Cel), Inactivated

本品系用甲型肝炎（简称甲肝）病毒接种人二倍体细胞，经培养、收获、病毒纯化、灭活后，加入铝佐剂制成。用于预防甲型肝炎。

生产和检定用设施、原材料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”的有关要求。

2.1  生产用细胞

　　生产用细胞为人二倍体细胞（2BS株、KMB17株或其他经批准的细胞株）。

　　2.1.1  细胞管理及检定

　　应符合“生物制品生产检定用动物细胞基质制备及质量控制”的有关规定。每批原液的生产应来自复苏扩增后的同一细胞批。

　　各级细胞库代次应不超过批准的限定代次。

　　2.1.2  细胞制备

　　取工作细胞库的细胞，经复苏、消化、置适宜温度下培养制备的一定数量并用于接种病毒的细胞为一个细胞批。

　　2.2  毒种

　　2.2.1  名称及来源

　　生产用毒种为甲肝病毒TZ84株、吕8株或其他批准的人二倍体细胞适应的甲肝病毒株。

　　2.2.2  种子批的建立

　　应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理及质量控制”的有关规定。

　　甲肝病毒TZ84株原始种子应不超过第20代，主种子批应不超过第22代，工作种子批应不超过第23代，生产的疫苗应不超过第24代。吕8株原始种子应不超过第24代，主种子批不超过第25代，工作种子批不超过第30代，生产的疫苗应不超过第31代。

　　2.2.3  种子批毒种的检定

　　主种子批应进行以下全面检定，工作种子批进行

　　2.2.3.1~2.2.3.4项检定。

　　2.2.3.1  鉴别试验

　　用甲肝病毒特异性免疫血清和甲肝病毒抗体阴性血清分别与500~1000CCID50/ml甲肝病毒等量混合，置37℃水浴60分钟，接种人二倍体细胞2BS株或KMB17/株，置35℃培养至病毒增殖高峰期，提取甲肝病毒后用酶联免疫吸附法（通则3429）测定，经中和的病毒液检测结果应为阴性，证明甲肝病毒被完全中和；未经中和的病毒液检测结果应为阳性，证明为甲肝病毒。

　　2.2.3.2  病毒滴定

　　将毒种做10倍系列稀释，取至少3个稀释度，分别接种人二倍体细胞，置35℃培养至病毒增殖高峰期，收获后提取甲肝病毒，用酶联免疫吸附法（通则3429）测定，病毒滴度应不低于6.50 lg CCID50/ml。

　　2.2.3.3  无菌检查

　　依法检查（通则1101），应符合规定。

　　2.2.3.4  支原体检查

　　依法检查（通则3301），应符合规定。

　　2.2.3.5  外源病毒因子检查

　　依法检查（通则3302），应符合规定。供试品可不经甲肝病毒特异性免疫血清中和，直接接种小鼠和细胞观察。

　　2.2.3.6  免疫原性检查

　　用主种子批毒种制备疫苗。取甲肝病毒抗体阴性、肝功能指标正常、体重为1.5~4.5kg的健康恒河猴7只，其中试验组5只，肌内注射1.0ml（甲肝病毒抗原含量应不低于一个成人剂量），另设2只为对照。免疫后28天采血，采用酶联免疫吸附法（通则3429）检测甲肝病毒抗体。对照组甲肝病毒抗体应全部为阴性，试验组至少有4只血清抗体阳转为合格。

　　2.2.4  毒种保存

　　毒种应于-60℃以下保存。

　　2.3  原液

　　2.3.1  细胞制备

　　按2.1.2项进行。

　　2.3.2  培养液

　　采用适宜的培养液进行培养。如培养液含新生牛血清，其质量应符合要求（通则3604），且甲肝抗体检测应为阴性。

　　2.3.3  对照细胞外源病毒因子检查

　　依法检查（通则3302），应符合规定。

　　2.3.4  病毒接种和培养

　　将毒种接种细胞进行培养，病毒接种量及培养条件按批准的执行。

　　2.3.5  病毒收获

　　培养至病毒增殖高峰期后，采用适宜浓度的胰蛋白酶或其他适宜方法消化含甲肝病毒的细胞，经离心或过滤的方法收集后为病毒收获物。

　　2.3.6  病毒收获物检定

　　按3.1项进行。

　　2.3.7  病毒提取

　　检定合格的病毒收获物经冻融和（或）超声波或其他适宜方法处理收获病毒后，用三氯甲烷抽提以提取甲肝病毒。

　　2.3.8  合并

　　检定合格的同一细胞批生产的单次病毒收获物经提取病毒后可进行合并。

　　2.3.9  病毒纯化

　　采用柱色谱法或其他适宜的方法进行纯化。纯化前或纯化后超滤浓缩至规定蛋白质含量范围内，纯化后取样进行抗原含量测定。

　　2.3.10  病毒灭活

　　纯化后甲肝病毒液除菌过滤后加入甲醛灭活病毒，具体工艺参数，包括收获液蛋白质含量和甲醛浓度等按批准的执行。病毒灭活到期后，每个病毒灭活容器应立即取样，分别进行病毒灭活验证试验。灭活后的病毒液即为原液。

　　2.3.11  病毒灭活验证试验

　　取灭活后病毒液，接种人二倍体细胞，置33~35℃培养适宜时间（TZ84株不少于21天，吕8株不少于12天）收获，同法盲传2代，用酶联免疫吸附法（通则3429）检测甲肝病毒，应为阴性。

　　2.3.12  原液检定

　　按3.2项进行。

　　2.3.13  原液保存

　　于2~8℃保存。

　　2.4  半成品

　　2.4.1  配制

　　病毒原液经铝吸附后，按规定的抗原含量进行稀释，可加入适宜浓度的2-苯氧乙醇作为抑菌剂及其他适宜稳定剂，即为半成品。

　　2.4.2  半成品检定

　　按3.3项进行。

　　2.5  成品

　　2.5.1  分批

　　应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定。

　　2.5.2  分装

　　应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定。

　　2.5.3  规格

　　每支0.5ml或1.0ml，每1次成人用剂量为1.0ml，儿童剂量为0.5ml，成人剂量和儿童剂量含甲肝病毒抗原含量按批准的执行。

　　2.5.4  包装

　　应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定。

3.1  病毒收获物检定

　　3.1.1  无菌检查

　　依法检查（通则1101），应符合规定。

　　3.1.2  支原体检查

　　依法检查（通则3301），应符合规定。

　　3.1.3  抗原含量

　　采用酶联免疫吸附法（通则3429）测定，应符合批准的要求。

　　3.1.4  蛋白质含量

　　依法测定（通则0731第二法），应符合批准的要求。

　　3.2  原液检定

　　3.2.1  无菌检查

　　依法检查（通则1101），应符合规定。

　　3.2.2  抗原含量

　　采用酶联免疫吸附法（通则3429）测定，应符合批准的要求。

　　3.2.3  蛋白质含量

　　依法测定（通则0731第二法），应符合批准的要求。

　　3.2.4  牛血清白蛋白残留量

　　应不高于100ng/ml（通则3411）。

　　3.2.5  去氧胆酸钠残留量

　　采用去氧胆酸钠作为细胞裂解剂的，按本品种附录1进行检测，残留量应不高于20μg/ml。

　　3.2.6  聚山梨酯80残留量

　　生产过程中使用聚山梨酯80的，残留量应不高于20μg/ml（通则3203）。

　　3.3  半成品检定

　　3.3.1  无菌检查

　　依法检查（通则1101），应符合规定。

　　3.3.2  pH值

　　应为5.5~7.0（通则0631）。

　　3.3.3  铝吸附效果测定

　　取吸附后上清液，用酶联免疫吸附法（通则3429）检测甲肝病毒抗原含量，上清液中甲肝病毒抗原含量应不高于吸附前抗原总量的5%。

　　3.3.4  铝含量

　　应不高于0.62mg/ml（通则3106）。

　　3.3.5  聚乙二醇6000残留量

　　生产过程中加入聚乙二醇6000的，残留量应小于10μg/ml（通则3202）。

　　3.4  成品检定

　　3.4.1  鉴别试验

　　采用酶联免疫吸附法（通则3429）检查，应证明含有甲肝病毒抗原。

　　3.4.2  外观

　　应为微乳白色混悬液体，可因沉淀而分层，易摇散，不应有摇不散的块状物。

　　3.4.3  装量

　　依法检查（通则0102），应不低于标示量。

　　3.4.4  pH值

　　应为5.5~7.0（通则0631）。

　　3.4.5  渗透压摩尔浓度

　　依法检查（通则0632），应符合批准的要求。

　　3.4.6  铝含量

　　应为0.35~0.62mg/ml（通则3106）。[1]

　　3.4.7  游离甲醛含量

　　应不高于50μg/ml（通则3207第二法）。

　　3.4.8  三氯甲烷残留量

　　应不高于0.006%（通则0861）。

　　3.4.9  2-苯氧乙醇含量

　　采用2-苯氧乙醇作为抑菌剂的进行该项检测，按本品种附录2进行检测，应为4.0~6.0mg/ml。

　　3.4.10  体外相对效力测定

　　应不低于0.75（通则3502）。

　　3.4.11  抗生素残留量

　　生产过程中加入抗生素的应进行该项检查。采用酶联免疫吸附法（通则3429），应不高于50ng/剂。

　　3.4.12  无菌检查

　　依法检查（通则1101），应符合规定。

　　3.4.13  细菌内毒素检查

　　应不高于10EU/ml（通则1143凝胶限度试验）。

　　3.4.14  异常毒性检查

　　依法检查（通则1141），应符合规定。

于2~8℃避光保存和运输。自生产之日起，按批准的有效期执行。

附录1  去氧胆酸钠残留量测定法

附录2  2-苯氧乙醇含量测定法

应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定和批准的内容。

附录1  去氧胆酸钠残留量测定法

　　本法系依据去氧胆酸钠在酸性条件下生成有色化合物，用比色法测定供试品中去氧胆酸钠的残留量。

　　试剂

　　（1）去氧胆酸钠对照品溶液（100μg/ml）

　　精密称取干燥至恒重的去氧胆酸钠0.05g于烧杯内，加入醋酸30ml使溶解，转入50ml量瓶内，用适量水冲洗烧杯洗液转入量瓶，再补加水至50ml。临用前10倍稀释即为100μg/ml。

　　（2）60%醋酸溶液

　　取醋酸150ml，加水100ml，混匀。

　　（3）43.5%硫酸溶液

　　量取浓硫酸453ml，缓慢加入500ml水中，边加边搅拌，补水至1000mL

　　测定法

　　取供试品1.0ml于50ml比色管中，加43.5%硫酸溶液14.0ml，摇匀，于70℃加热20分钟，冷却至室温，照紫外-可见分光光度法（通则0401）在波长387nm处测定吸光度。

　　精密吸取去氧胆酸钠对照品溶液（100μg/ml）0ml、0.1ml、0.2ml、0.4ml、0.8ml于50ml比色管中，各加60%醋酸溶液至1.0ml，使去氧胆酸钠浓度分别为0μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml、80μg/ml，自"加43.5%硫酸溶液14.0ml”起，同法操作，测定各管吸光度。

　　以去氧胆酸钠对照品溶液的浓度对其相应的吸光度作直线回归，将供试品溶液的吸光度代入回归方程，计算供试品中去氧胆酸钠含量。

　　附录2  2-苯氧乙醇含量测定法

　　本法系采用高效液相色谱法测定2-苯氧乙醇含量。

　　照高效液相色谱法（通则0512）测定。

　　色谱条件  采用C18柱，粒度10μm；流动相为水-乙腈（50/50），检测波长为270nm，流速为每分钟1ml。

　　对照品溶液的制备

　　准确称取2-苯氧乙醇对照品50mg于10ml量瓶中，用流动相定容至10ml，用0.45μm滤膜过滤。

　　供试品溶液的制备

　　取供试品1ml，用0.45μm滤膜过滤。

　　测定法

　　精密量取同体积的对照品溶液和供试品溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图；上样量为10μl。

　　按下式计算：

中华人民共和国药典：2020年版.三部/国家药典委员会编. —北京：中国医药科技出版社，2020.5 ISBN 978-7-5214-1575-9