Ren Baijiesu-2 Zhusheye

Human Interleukin-2 Injection

本品系由高效表达人白细胞介素-2（简称人白介素-2）基因的大肠埃希菌，经发酵、分离和高度纯化后获得的人白介素-2制成。含适宜稳定剂，不含抑菌剂和抗生素。

生产和检定用设施、原材料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”的有关要求。

2.1  工程菌菌种

　　2.1.1  名称及来源

　　人白介素-2工程菌株系由带有人白介素-2基因的重组质粒转化的大肠埃希菌菌株。

　　2.1.2  种子批的建立

　　应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理及质量控制"的规定。

　　2.1.3  菌种检定

　　主种子批和工作种子批的菌种应进行以下各项全面检定。

　　2.1.3.1  划种LB琼脂平板

　　应呈典型大肠埃希菌集落形态，无其他杂菌生长。

　　2.1.3.2  染色镜检

　　应为典型的革兰氏阴性杆菌。

　　2.1.3.3  对抗生素的抗性

　　应与原始菌种相符。

　　2.1.3.4  电镜检查（工作种子批可免做）

　　应为典型大肠埃希菌形态，无支原体、病毒样颗粒及其他微生物污染。

　　2.1.3.5  生化反应

　　应符合大肠埃希菌生化反应特性。

　　2.1.3.6  人白介素-2表达量

　　在摇床中培养，应不低于原始菌种的表达量。

　　2.1.3.7  质粒检查

　　该质粒的酶切图谱应与原始重组质粒的相符。

　　2.1.3.8  目的基因核苷酸序列检查（工作种子批可免做）

　　目的基因核苷酸序列应与批准的序列相符。

　　2.2  原液

　　2.2.1  种子液制备

　　将检定合格的工作种子批菌种接种于适宜的培养基（可含适量抗生素）中培养。

　　2.2.2  发酵用培养基

　　釆用适宜的不含抗生素的培养基。

　　2.2.3  种子液接种及发酵培养

　　2.2.3.1  在灭菌培养基中接种适量种子液。

　　2.2.3.2  在适宜的温度下进行发酵，应根据经批准的发酵工艺进行，并确定相应的发酵条件，如温度、pH值、溶解氧、补料、发酵时间等。发酵液应定期进行质粒丢失率检查（通则3406）。

　　2.2.4  发酵液处理

　　用适宜的方法收集、处理菌体。

　　2.2.5  初步纯化

　　采用经批准的纯化工艺进行初步纯化，使其纯度达到规定的要求。

　　2.2.6  高度纯化

　　经初步纯化后，采用经批准的纯化工艺进行高度纯化，使其达到3.1项要求，加入适宜稳定剂，除菌过滤后即为人白介素-2原液。如需存放，应规定时间和温度。

　　2.2.7  原液检定

　　按3.1项进行。

　　2.3  半成品

　　2.3.1  配制与除菌

　　按经批准的配方配制稀释液。配制后应立即用于稀释。

　　将原液用稀释液稀释至所需浓度，除菌过滤后即为半成品，保存于2~8℃。

　　2.3.2  半成品检定

　　按3.2项进行。

　　2.4  成品

　　2.4.1  分批

　　应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定。

　　2.4.2  分装

　　应符合“生物制品分包装及贮运管理”与通则0102有关规定。

　　2.4.3  规格

　　50万IU（0.4ml）/瓶；100万IU（0.8ml）/瓶

　　2.4.4  包装

　　应符合“生物制品分包装及贮运管理”与通则0102有关规定。

　　3.1  原液检定

　　3.1.1  生物学活性

　　依法测定（通则3524）。

　　3.1.2  蛋白质含量

　　依法测定（通则0731第二法）。

　　3.1.3  比活性

　　为生物学活性与蛋白质含量之比，每lmg蛋白质应不低于1.0×107IU。

　　3.1.4  纯度

　　3.1.4.1  电泳法

　　依法测定（通则0541第五法）。用非还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，分离胶的胶浓度为15%，加样量应不低于10μg（考马斯亮蓝R250染色法）或5μg（银染法）。经扫描仪扫描，纯度应不低于95.0%。

　　3.1.4.2  高效液相色谱法

　　依法测定（通则0512）。色谱柱以适合分离分子质量为5~60kD蛋白质的色谱用凝胶为填充剂；流动相为0.1mol/L磷酸盐-0.1mol/L氯化钠缓冲液，pH7.0（含适宜的表面活性剂）；上样量应不低于20μg，在波长280nm处检测。以人白介素-2色谱峰计算的理论板数应不低于1500。按面积归一化法计算，人白介素-2主峰面积应不低于总面积的95.0%。

　　3.1.5  分子量

　　依法测定（通则0541第五法）。用还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，分离胶的胶浓度为15%，加样量应不低于1.0μg，制品的分子质量应为15.5kD±1.6kD。

　　3.1.6  外源性DNA残留量

　　每1支/瓶应不高于10ng（通则3407）。

　　3.1.7  宿主菌蛋白质残留量

　　应不高于蛋白质总量的0.10%（通则3412）。

　　3.1.8  残余抗生素活性

　　依法测定（通则3408），不应有残余氨苄西林或其他抗生素活性。如制品中含有SDS，应将SDS浓度至少稀释至0.01%再进行测定。

　　3.1.9  细菌内毒素检查

　　依法检查（通则1143），每100万IU应小于10EU。如制品中含有SDS，应将SDS浓度至少稀释至0.0025%再进行测定。

　　3.1.10  等电点

　　主区带应为6.5~7.5，且供试品的等电点图谱应与对照品的一致（通则0541第六法）。

　　3.1.11  紫外光谱

　　用水或0.85%~0.90%氯化钠溶液将供试品稀释至100~500μg/ml，在光路lcm、波长230~360nm下进行扫描，最大吸收峰波长应为277nm±3nm（通则0401）。

　　3.1.12  肽图

　　依法测定（通则3405），应与对照品图形一致。

　　3.1.13  N端氨基酸序列（至少每年测定1次）

　　用氨基酸序列分析仪测定，N端序列应为：

　　（Met）-Ala-Pro-Thr-Ser-Ser-Ser-Thr-Lys-Lys-Thr-Gln-Leu-Gln-Leu-Glu。

　　3.2  半成品检定

　　3.2.1  细菌内毒素检查

　　依法检查（通则1143），每100万IU应小于10EU。如制品中含有SDS，应将SDS浓度至少稀释至0.0025%再进行测定。

　　3.2.2  无菌检查

　　依法检查（通则1101），应符合规定。

　　3.3  成品检定

　　3.3.1  鉴别试验

　　按免疫印迹法（通则3401）或免疫斑点法（通则3402）测定，应为阳性。

　　3.3.2  物理检查

　　3.3.2.1  外观

　　应为无色或微黄色澄明液体。

　　3.3.2.2  可见异物

　　依法检查（通则0904），应符合规定。

　　3.3.2.3  装量

　　依法检查（通则0102），应不低于标示量。

　　3.3.3  化学检定

　　3.3.3.1  pH值

　　应为3.5~4.5（通则0631）。

　　3.3.3.2  渗透压摩尔浓度

　　依法测定（通则0632），应符合批准的要求。

　　3.3.4  生物学活性

　　应为标示量的80%~150%（通则3524）。

　　3.3.5  残余抗生素活性

　　依法测定（通则3408），不应有残余氨苄西林或其他抗生素活性。如制品中含有SDS，应将SDS浓度至少稀释至0.01%再进行测定。

　　3.3.6  无菌检查

　　依法检查（通则1101），应符合规定。

　　3.3.7  细菌内毒素检查

　　依法检查（通则1143），每1支/瓶应小于10EU。如制品中含有SDS，应将SDS浓度至少稀释至0.0025%再进行测定。

　　3.3.8  异常毒性试验

　　依法检查（通则1141小鼠试验法），应符合规定。

　　3.3.9  残余乙腈含量

　　如工艺中采用乙腈，则照气相色谱法（通则0521）进行。色谱柱采用石英毛细管柱，柱温45℃，气化室温度150℃，检测器温度300℃，载气为氮气，流速为每分钟4.0ml，用水稀释乙腈标准溶液使其浓度为0.0004%，分别吸取1.0ml上述标准溶液及供试品溶液顶空进样400μl，通过比较标准溶液和供试品溶液的峰面积判定供试品溶液乙腈含量。乙腈含量不高于0.0004%。

于2~8℃避光保存和运输。自生产之日起，按批准的有效期执行。

应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定和批准的内容。

中华人民共和国药典：2020年版.三部/国家药典委员会编. —北京：中国医药科技出版社，2020.5 ISBN 978-7-5214-1575-9