Ren Biaopi Shengzhangyinzi Diyanye

Human Epidermal Growth Factor Eye Drops

本品系由高效表达人表皮生长因子基因的酵母，经发酵、分离和高度纯化后制成。含适宜稳定剂，不含抑菌剂和抗生素。

生产和检定用设施、原料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”的有关要求。

2.1  工程菌菌种

　　2.1.1  名称及来源

　　人表皮生长因子工程菌株，系由带有人工合成的人表皮生长因子基因的DNA片段整合到酵母菌染色体基因组中构建而成。

　　2.1.2  种子批的建立

　　应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理及质量控制”的规定。

　　2.1.3  菌种检定

　　主种子批和工作种子批的菌种应进行以下各项全面检定。

　　2.1.3.1  划种BMG1琼脂平板

　　应呈典型酵母菌菌落形态，无其他杂菌生长。

　　2.1.3.2  染色镜检

　　在光学显微镜下观察，应形状规则，用次甲蓝染色，无死亡细胞。

　　2.1.3.3  筛选标志检查

　　应符合该基因表型特征。

　　2.1.3.4  人表皮生长因子表达量

　　在摇床中培养，应不低于原始菌种的表达量。

　　2.1.3.5  人表皮生长因子基因稳定性检查

　　涂BMG1琼脂平板，挑选至少50个克隆，用PCR检测人表皮生长因子基因，阳性率应不低于95%。

　　2.2  原液

　　2.2.1  种子液制备

　　将检定合格的工作种子批菌种接种于适宜的培养基中培养，供发酵罐接种用。

　　2.2.2  发酵用培养基

　　采用适宜的不含任何抗生素的培养基。

　　2.2.3  种子液接种及发酵培养

　　2.2.3.1  在灭菌培养基中接种适量种子液。

　　2.2.3.2  在适宜温度下进行发酵，应采用经批准的发酵工艺，并确定相应的发酵条件，如温度、pH值、溶解氧、补料、发酵时间等。

　　2.2.4  发酵液处理

　　用适宜的方法收集上清液。

　　2.2.5  纯化

　　采用经批准的纯化工艺进行纯化，使其达到3.1项要求，除菌过滤后即为人表皮生长因子原液。如需存放，应规定时间和温度。

　　2.2.6  原液检定

　　按3.1项进行。

　　2.3  半成品

　　2.3.1  配制与除菌

　　按经批准的配方配制稀释液，配制后应立即用于稀释。

　　原液用稀释液稀释至所需浓度，除菌过滤后即为半成品，应立即分装或保存于2～8℃。

　　2.3.2  半成品检定

　　按3.2项进行。

　　2.4  成品

　　2.4.1  分批

　　应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定。

　　2.4.2  分装

　　应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定。

　　2.4.3  规格

　　21000IU（5ml）/瓶。[1]同品种用于眼内注射、眼内插入、外科手术和急救时，均不得添加抑菌剂或抗氧剂或不适当的缓冲剂，且应包装于无菌容器内供一次性使用。

　　2.4.4  包装

　　应符合“生物制品分包装及贮运管理”和通则0105的有关规定。

3.1  原液检定

　　3.1.1  生物学活性

　　依法测定（通则3528）。

　　3.1.2  蛋白质含量

　　依法测定（通则0731第二法）。

　　3.1.3  比活性

　　为生物学活性与蛋白质含量之比，每1mg蛋白质应不低于5.0×10⁵IU。

　　3.1.4  纯度

　　3.1.4.1  电泳法

　　依法测定（通则0541第五法）。用非还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，分离胶的胶浓度为15%，加样量应不低于10μg（考马斯亮蓝R250染色法）或5μg（银染法）。经扫描仪扫描，纯度应不低于95.0%。

　　3.1.4.2  高效液相色谱法

　　依法测定（通则0512）。色谱柱采用丁基硅烷键合硅胶为填充剂；以A（三氟乙酸-水溶液：取0.5ml三氟乙酸加水至1000ml，充分混匀）、B（三氟乙酸-乙腈溶液：取0.5ml三氟乙酸加入色谱纯乙腈至1000ml，充分混匀）为流动相，在室温条件下，进行梯度洗脱（22%～37%流动相B）；上样量应不低于5μg，在波长280nm处检测。以人表皮生长因子色谱峰计算理论板数，应不低于500；按面积归一化法计算，人表皮生长因子主峰面积应不低于总面积的95.0%。

　　3.1.5  分子量

　　依法测定（通则0541第五法）。用还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，分离胶的胶浓度为15.0%，加样量应不低于1.0μg，供试品的分子质量应为5.90kD±0.59kD。

　　3.1.6  外源性DNA残留量

　　每100μg蛋白质应不高于10ng（通则3407）。

　　3.1.7  宿主菌蛋白质残留量

　　应不高于总蛋白质的0.1%（通则3414）。

　　3.1.8  甲醇含量

　　甲醇含量应不高于0.002%（通则0521）。

　　3.1.9  等电点

　　主区带应为4.0～5.0（通则0541第六法）。

　　3.1.10  紫外光谱

　　最大吸收峰波长应为277nm±3nm（通则0401）。

　　3.1.11  肽图（至少每半年测定1次）

　　依法测定（通则3405），应与对照品图形一致。

　　3.1.12  N端氨基酸序列（至少每年测定1次）

　　用氨基酸序列分析仪测定，N端序列应为：

　　Asn-Ser-Asp-Ser-Glu-Cys-Pro-Leu-Ser-His-Asp-Gly-Tyr-Cys-Leu。

　　3.1.13  鉴别试验

　　按免疫印迹法（通则3401）或免疫斑点法（通则3402）测定，应为阳性。

　　3.2  半成品检定

　　无菌检查

　　依法检查（通则1101），应符合规定。

　　3.3  成品检定

　　3.3.1  鉴别试验

　　按免疫印迹法（通则3401）或免疫斑点法（通则3402）测定，应为阳性。

　　3.3.2  物理检查

　　3.3.2.1  外观

　　应为无色澄清液体。

　　3.3.2.2  可见异物

　　依法检查（通则0904），应符合规定。

　　3.3.2.3  装量

　　依法检查（通则0942），应符合规定。

　　3.3.3  化学检定

　　3.3.3.1  pH值

　　应为6.9～7.3（通则0631）。

　　3.3.3.2  渗透压摩尔浓度

　　依法测定（通则0632），应符合批准的要求。

　　3.3.4  生物学活性

　　应为标示量的70%～200%（通则3528）。

　　3.3.5  无菌检查

　　依法检查（通则1101），应符合规定。

于4～25℃避光保存和运输。自分装之日起，按批准的有效期执行。

应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定和批准的内容。

中华人民共和国药典：2020年版.三部/国家药典委员会编. —北京：中国医药科技出版社，2020.5 ISBN 978-7-5214-1575-9