Kangboxipu Yanyong Zhusheye

Conbercept Ophthalmic Injection

本品系由可高效表达人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白基因的中国仓鼠卵巢（CHO）细胞，经细胞培养、蛋白收获并纯化后获得的重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白制成。不含抑菌剂和抗生素。

生产和检定用设施、原材料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”的有关要求。

2.1  工程细胞

　　2.1.1  名称及来源

　　康柏西普工程细胞由含有人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白基因的质粒转染中国仓鼠卵巢（CHO）细胞构建而成。

　　2.1.2  细胞库建立、传代及保存

　　原始细胞传代、扩增后保存于液氮或 -130℃以下，作为主细胞库。从主细胞库的细胞传代、扩增后保存于液氮或 -130℃以下，作为工作细胞库。各级细胞库细胞传代应不超过批准的代次，细胞库检定合格后方可用于生产。

　　2.1.3  主细胞库及工作细胞库的检定

　　应符合“生物制品生产检定用动物细胞基质制备及质量控制”规定。

　　2.1.3.1  细胞鉴别

　　应用同工酶分析、生物化学、免疫学、细胞学和遗传标记物等任一方法进行鉴别，应为典型CHO细胞。

　　2.1.3.2  内、外源因子检查

　　细菌和真菌、分枝杆菌、支原体、病毒因子检查应符合规定。

　　2.1.3.3  目的蛋白表达量测定

　　表达量应符合批准要求。

　　2.1.3.4  目的基因核苷酸序列检查（工作细胞库可免做）

　　目的基因核苷酸序列应与批准的序列相符。

　　2.2  原液

　　2.2.1  细胞的复苏与扩增

　　从工作细胞库来源的细胞复苏后，进行传代、扩增，供生物反应器接种用。

　　2.2.2  生产用细胞培养液

　　生产用细胞培养液应不含任何血清和抗生素。

　　2.2.3  细胞培养

　　采用经批准工艺进行细胞培养，收集含目的产物的培养液，即“收获液”。细胞培养全过程应严格按照无菌操作。

　　2.2.4  分离纯化

　　收获液采用经批准的工艺进行纯化和病毒灭活，制得高纯度的康柏西普蛋白。除菌过滤后即为康柏西普原液，保存于适宜温度，并规定其有效期。

　　2.2.5  原液检定

　　按3.1项进行。

　　2.3  半成品

　　2.3.1  配制与除菌

　　按批准的工艺将原液用缓冲液稀释，除菌过滤后即为半成品。

　　2.3.2  半成品检定

　　按3.2项进行。

　　2.4  成品

　　2.4.1  分批

　　应符合“生物制品分包装及贮运管理”有关规定。

　　2.4.2  分装

　　应符合“生物制品分包装及贮运管理”、通则0102与通则0105规定。

　　2.4.3  规格

　　2mg（0.2ml）/支

　　2.4.4  包装

　　应符合“生物制品分包装及贮运管理”、通则0102与通则0105规定。

　　2.4.5  成品检定

　　按3.3项进行。

　　3.1  原液检定

　　3.1.1  鉴别试验

　　3.1.1.1  肽图

　　依法检查（通则3405第一法）。取供试品适量（约相当于0.2mg蛋白质），加入表面活性剂、1mol/L二硫苏糖醇（DTT）溶液和50mmol/L碳酸氢铵溶液，煮沸10分钟变性还原，冷却后加入1mol/L碘乙酰胺（IAA）溶液，室温避光封闭45分钟。用50mmol/L碳酸氢铵超滤换液，按照1∶25（mg/mg）加入测序级胰蛋白酶，37℃±1℃酶切16～20小时，加入10%三氟乙酸终止，12000g离心5分钟（2～8℃），取上清液作为供试品溶液。色谱柱为碳十八反相色谱柱（如：2.1mm×15cm，粒度1.8μm或其他适宜的色谱柱），柱温60℃；流速为每分钟0.2ml；检测波长214nm；取适宜体积注入超高效液相色谱仪，按下表进行梯度洗脱（表中流动相A为0.1%三氟乙酸水溶液，流动相B为0.085%三氟乙酸-乙腈溶液）。标准品同法操作。

　　供试品肽图应与康柏西普标准品一致。

　　3.1.1.2  N端氨基酸序列（至少每年测定1次）

　　用氨基酸序列分析仪或质谱法测定，N端序列应为：

　　Gly-Arg-Pro-Phe-Val-Glu-Met-Tyr-Ser-Glu-Ile-Pro-Glu-Ile-Ile。

　　3.1.1.3  分子量

　　依法检查（通则0541第五法）。使用还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，分离胶的胶浓度为10%，加样量2μg。分子量应为67.0～81.8kD。

　　3.1.1.4  电荷异质性

　　用还原固定pH梯度-等电聚焦法测定。取供试品适量（相当于0.18～0.25mg蛋白质）加入8mol/L尿素-100mmol/L Tris-HCl（pH8.0）溶液、1mol/L二硫苏糖醇（DTT）溶液，37℃还原3小时，冷却后加入0.5mol/L碘乙酰胺（IAA）溶液，室温避光封闭1小时。用8mol/L尿素超滤换液，之后加入溶胀液混匀后，加入电泳槽，取固定pH梯度胶条浸入其中，水化5小时。标准品同法操作。按下表程序进行等电聚焦。

　　供试品电荷异质性应与标准品基本一致。

　　3.1.2  纯度和杂质

　　3.1.2.1  电泳法

　　依法检查（通则0541第五法）。使用还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，分离胶浓度为10%，加样量4μg。主峰面积百分比应不低于96.0%。

　　3.1.2.2  高效液相色谱法

　　依法检查（通则0514）。采用亲水硅胶体积排阻色谱柱（如：7.8mm×30cm，粒度5μm或其他适宜的色谱柱），流动相为20mmol/L磷酸氢二钠-150mmol/L氯化钠-200mmol/L精氨酸缓冲液，pH7.2±0.1，流速为每分钟0.5ml，检测波长280nm，上样量为50～200μg。按面积归一化法计算纯度，康柏西普主峰面积应不低于总面积的98.0%。

　　3.1.2.3  宿主细胞DNA残留量

　　依法检查（通则3407第三法）。每1mg康柏西普应不高于30pg。

　　3.1.2.4  宿主细胞蛋白质残留量

　　依法检查（通则3429），用经验证的酶联免疫吸附法测定，每1mg康柏西普应不高于30ng。

　　3.1.2.5  蛋白质A残留量

　　依法检查（通则3429），用经验证的酶联免疫吸附法测定，每1mg康柏西普应不高于20ng。

　　3.1.3  效价

　　3.1.3.1  生物学活性

　　依法检查（通则3535），应为标准品的60%～140%。

　　3.1.3.2  相对结合活性

　　依法检查（通则3535），应为标准品的60%～140%。

　　3.1.4  蛋白质含量

　　依法检查（通则0731第六法）。用消光系数法测定，以供试品缓冲液作为空白，测定供试品溶液在波长280nm处吸光度。按下列公式计算供试品蛋白质含量，蛋白质含量应不低于10.0mg/ml。

　　蛋白质含量（mg/ml）=（OD₂₈₀×n）/（E×L）

　　式中：OD₂₈₀为供试品溶液在波长280nm处吸光度；n为稀释倍数；E为康柏西普蛋白的消光系数，即1.175ml/（mg•cm）；L为光程（cm）。

　　3.1.5  糖谱

　　依法检查（通则0512），离子交换色谱法。取供试品适量（相当于0.8～1.0mg蛋白质），加水超滤换液，肽N-糖苷酶F（PNGase F）37℃±1℃孵育，固相萃取后真空离心干燥；处理后样品加入2-氨基苯甲酰胺（2-AB）标记液，65℃±1℃反应3.0～3.5小时，固相萃取后真空离心干燥，加水复溶作为供试品溶液。色谱柱为阴离子交换柱（如：2.1mm×25cm，粒度5μm或其他适宜的色谱柱）；柱温为室温；流速为每分钟0.2ml；荧光激发波长为330nm，荧光发射波长为420nm；取适宜体积供试品溶液注入超高效液相色谱仪，按下表进行梯度洗脱（表中流动相A为20%乙腈水溶液，流动相B为200mmol/L甲酸铵-20%乙腈水溶液）。按照面积归一化法计算各N-糖型比例。

　　按下列公式计算供试品Z值，Z值应为0.80～1.50。

　　式中：

　　3.1.6  唾液酸含量

　　依法检查（通则0512），反相色谱法。取供试品适量（相当于1.1～1.3mg蛋白质），加水超滤换液后，加入5mol/L乙酸溶液混匀。在唾液酸对照品系列稀释液中加入5mol/L乙酸溶液混匀。上述溶液置80℃±2℃加热2.0～2.5小时，加入4，5-亚甲二氧基-1，2-邻苯二胺（DMB）标记液于50℃±1℃反应3.0～3.5小时，加水稀释标记后的供试品和对照品。色谱柱为碳十八反相色谱柱（如：2.lmm×15cm，粒度1.8μm或其他适宜的色谱柱）；柱温35℃；流速为每分钟0.2ml；荧光激发波长为373nm，荧光发射波长为448nm；取适宜体积供试品和对照品溶液注入超高效液相色谱仪；按下表进行等度洗脱（表中流动相A为0.1%甲酸-水溶液，流动相B为0.1%甲酸-乙腈溶液）。

　　绘制唾液酸对照品标准曲线，计算供试品唾液酸含量。每1mol康柏西普的唾液酸含量应为8.0～18.0mol。

　　3.1.7  细菌内毒素检查

　　依法检查（通则1143），应小于0.4EU/ml。

　　3.2  半成品检定

　　3.2.1  细菌内毒素检查

　　依法检查（通则1143），应小于0.4EU/ml。

　　3.2.2  无菌检查

　　依法检查（通则1101薄膜过滤法），应符合规定。

　　3.3  成品检定

　　3.3.1  鉴别试验

　　3.3.1.1  分子结构域

　　依法检查（通则3402）。取标准品和供试品各1μg分别点样于三块膜上，然后分别加入标记抗KDR抗体、抗Flt-1抗体、抗IgG-Fc抗体进行特异性结合，显色。应与标准品一致。

　　3.3.1.2  电荷异质性

　　按照3.1.1.4项进行，电荷异质性应与标准品基本一致。

　　3.3.2  纯度

　　按照3.1.2.2项进行，纯度应不低于95.0%。

　　3.3.3  效价

　　3.3.3.1  生物学活性

　　依法检查（通则3535），应为标准品的60%～140%。

　　3.3.3.2  相对结合活性

　　依法检查（通则3535），应为标准品的60%～140%。

　　3.3.4  蛋白质含量

　　按照3.1.4项进行，应为9.0～11.0mg/ml。

　　3.3.5  理化检定

　　3.3.5.1  外观

　　应为无色的澄明液体。

　　3.3.5.2  可见异物

　　依法检查（通则0904第一法），应符合规定。

　　3.3.5.3  不溶性微粒检查

　　依法检查（通则0903第一法）。以下测试均应在层流条件和适宜的微粒分析仪中进行，测试过程应注意不得引入外来微粒，同时应避免气泡对测试结果的干扰。取微粒检查用水依法至少测定6次，每次进样体积设为1ml，弃第一次测定数据。后续每次测定均应满足：每1ml中≥10μm的不溶性微粒≤1粒，≥25μm的不溶性微粒＜1粒。取供试品混匀，釆用经确认的方法脱气，依法至少测定4次，每次进样体积不少于1ml，弃第一次测定数据，取后续测定数据的平均值作为测定结果。每1ml供试品中，含10μm及10μm以上的微粒数不得过50粒，含25μm及25μm以上的微粒数不得过5粒，含50μm及50μm以上的微粒数不得过2粒。

　　3.3.5.4  装量

　　依法检查（通则0102），用称重法测定，应不少于标示量。

　　3.3.5.5  pH值

　　依法检查（通则0631），应为7.4～8.0。

　　3.3.5.6  渗透压摩尔浓度

　　依法检查（通则0632），应为240～360mOsmol/kg。

　　3.3.6  聚山梨酯20含量

　　若工艺中添加聚山梨酯20，使用比色法测定。取适当稀释后的供试品溶液200μl加入5ml乙醇-氯化钠饱和溶液混匀，离心取上清液，用气体吹扫法干燥后加1ml水复溶。取1mg/ml聚山梨酯20对照品溶液0、25μl、50μl、75μl、100μl、150μl、200μl各加入1ml水中，混匀。上述溶液各加入2ml二氯甲烷和3ml硫氰铵钴溶液，弃上层溶液，照紫外-可见分光光度法（通则0401），在波长620nm处测定下层溶液吸光度值。用二氯甲烷作为空白对照。以上述聚山梨酯20对照品溶液系列浓度对其相应的吸光度值作直线回归，相关系数应不低于0.98，将供试品吸光度值代入直线回归方程，求得供试品聚山梨酯20含量。聚山梨酯20含量应为250～750μg/ml。

　　3.3.7  精氨酸含量

　　若工艺中添加精氨酸，依法检查（通则0512），反相色谱法。取适当稀释后的供试品溶液200μl加入800μl甲醇，10000g离心15分钟，取上清液与邻苯二甲醛溶液进行衍生反应。精氨酸对照品系列稀释溶液同法操作。色谱柱为碳十八反相色谱柱（如：4.6mm×15cm，粒度3.5μm或其他适宜的色谱柱）；柱温40℃；流速为每分钟1ml，检测波长为338nm；按下表梯度洗脱（表中流动相A为pH7.8的40mmol/L NaH2PO4水溶液，流动相B为甲醇∶乙腈∶水为45∶45∶10的溶液）。

　　绘制精氨酸对照品标准曲线，计算供试品精氨酸含量。精氨酸含量应为80～120mmol/L。

　　3.3.8  无菌检查

　　依法检查（通则1101薄膜过滤法），应符合规定。

　　3.3.9  细菌内毒素检查

　　依法检查（通则1143），应小于0.4EU/ml。

　　3.3.10  异常毒性检查

　　依法检查（通则1141小鼠试验法），应符合规定。

于2～8℃避光保存和运输。自生产之日起，按批准的有效期执行。

应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定和批准的内容。

中华人民共和国药典：2020年版.三部/国家药典委员会编. —北京：中国医药科技出版社，2020.5 ISBN 978-7-5214-1575-9