Zhusheyong A Xing Roudu Dusu

Botulinum Toxin Type A for Injection

本品系用A型肉毒结晶毒素经稀释，加入稳定剂后冻干制成。

生产和检定用设施、原材料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”的有关要求。

2.1  菌种

　　生产用菌种应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理及质量控制”的有关规定。

　　2.1.1  名称及来源

　　生产用菌种为产毒高的A型肉毒梭菌Hall株或其他A型肉毒梭菌。

　　2.1.2  种子批的建立

　　应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理及质量控制”的有关规定。

　　2.1.3  种子批的传代

　　主种子批应不超过5代，工作种子批应不超过10代。

　　2.1.4  种子批菌种的检定

　　2.1.4.1  形态、培养特性及生化特性

　　检定菌种可采用明胶琼脂半固体培养基、血琼脂平板培养基、卵黄琼脂平板培养基。

　　菌种应具有典型的形态特征和培养特性及生化特性，应产生不低于1.0×10⁵LD₅₀/ml的A型肉毒毒素。

　　2.1.4.2  基因稳定性试验

　　每批工作种子应进行A型肉毒神经毒素基因稳定性试验。菌种神经毒素基因核苷酸序列与基因库中登录号为AF488749的A型肉毒梭菌Hall株的神经毒素基因区核苷酸序列同源性应不低于99.0%。

　　2.1.5  种子批的保存

　　主种子批和工作种子批均应冻干保存于8℃以下，工作种子批也可接种于适宜培养基，8℃以下保存。

　　2.2  毒素原液

　　2.2.1  生产用种子

　　启开工作种子批菌种复苏后，在适宜培养基上扩增培养，制备生产用种子。

　　2.2.2  产毒培养基

　　采用含胰酶消化酪蛋白、酵母透析液（或酵母浸出粉）、葡萄糖培养基，或经批准的其他适宜培养基。

　　2.2.3  接种和培养

　　生产用种子接种产毒培养基后，在适宜温度培养一定时间。每瓶取样镜检，应无杂菌，经除菌过滤，即为原制毒素，其毒力应不低于1.0×10⁵LD₅₀/ml。

　　2.2.4  结晶毒素

　　2.2.4.1  纯化及结晶

　　原制毒素可经等电点沉淀、核糖核酸酶处理、离子交换色谱、硫酸铵浓缩和透析及自然结晶等程序，或用经批准的其他适宜方法进行纯化。纯化毒素经自然结晶后即为结晶毒素。

　　2.2.4.2  保存

　　于2～8℃避光保存。

　　2.2.4.3  结晶毒素检定

　　按3.1项进行。

　　2.2.5  透析

　　用PB溶解结晶毒素，经透析去除硫酸铵，除菌过滤后即为原液。

　　2.2.6  原液检定

　　按3.2项进行。

　　2.3  半成品

　　2.3.1  配制

　　用0.85%～0.90%氯化钠溶液或其他适宜稀释液将已知毒力的毒素溶液稀释至适当浓度，加入适宜稳定剂，使每1ml毒素溶液的毒力在规定范围内。

　　2.3.2  半成品检定

　　按3.3项进行。

　　2.4  成品

　　2.4.1  分批

　　应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定。

　　2.4.2  分装及冻干

　　应符合“生物制品分包装及贮运管理”及通则0102有关规定。在冻干过程中制品温度应不高于35℃，真空或充氮封口。

　　2.4.3  规格

　　每瓶含A型肉毒毒素50U、100U。

　　2.4.4  包装

　　应符合“生物制品分包装及贮运管理”及通则0102有关规定。

3.1  结晶毒素检定

　　3.1.1  结晶毒素在普通光学显微镜高倍镜下观察，应呈均一的针状或棒状结晶。

　　3.1.2  毒力测定

　　可选择下列一种方法进行。毒力应不低于1.0×10⁶LD₅₀/ml。

　　3.1.2.1  本品溶解透析后做适当倍数稀释，按Broff法测定毒力，计算出本品的毒力。即取26～30日龄SPF级昆明小鼠5只，每只尾静脉注射0.1ml本品（或稀释的供试品），求其平均死亡时间（以分钟计），从毒素剂量与死亡时间的标准曲线中求得毒素的毒力。

　　3.1.2.2  按常规方法稀释本品，各稀释度腹腔注射26～30日龄SPF级昆明小鼠4只，每只注射0.5ml，根据动物4天内死亡情况，用统计学方法（Reed-Muench法）计算本品的毒力。

　　3.1.3  纯度测定

　　3.1.3.1  根据波长280nm处吸光度计算的蛋白质浓度及3.1.2项测定的毒力，求出结晶毒素的纯度，每1mg蛋白质纯度应在1.0×10⁷LD₅₀以上。

　　3.1.3.2  波长260nm处吸光度与波长280nm处吸光度之比（A₂₆₀/A₂₈₀）应不高于0.6。

　　3.1.4  特异性检查

　　取注射用水1ml，溶解A、B、C、D、E、F型冻干肉毒诊断血清，分别于各血清管中加1ml含100LD50左右的本品。另取2支试管，各加1ml0.85%～0.90%氯化钠溶液，再分别加入上述同浓度的本品溶液，其中1支煮沸20分钟作为毒素阴性对照，另1支与混有毒素的诊断血清管同时置37℃结合45分钟，作为毒素阳性对照。各组分别腹腔注射26～30日龄SPF级昆明小鼠2～3只，每只注射0.5ml，观察4日内小鼠死亡情况，A型肉毒毒素判定标准：A型、混合型和阴性对照组小鼠存活，其他型（B、C、D、E、F型）和毒素对照组小鼠死亡，则毒素为A型肉毒毒素。

　　3.1.5  蛋白质图谱

　　按SDS-PAGE法（通则0541）检查结晶毒素的蛋白组成，在非还原和还原条件下电泳，电泳图谱应与参考品一致。

　　3.2  原液检定

　　按3.1.2～3.1.4项进行。

　　3.3  半成品检定

　　无菌检查

　　依法检查（通则1101），应符合规定。

　　3.4  成品检定

　　除水分测定、装量差异检查外，每瓶加入2.5ml氯化钠注射液，复溶后进行以下检定。

　　3.4.1  鉴别试验

　　按3.1.4项进行，应符合规定。

　　3.4.2  物理检查

　　3.4.2.1  外观检查

　　应为白色疏松体，复溶后轻轻摇动，应呈无色或淡黄色澄明液体。

　　3.4.2.2  装量差异

　　依法检查（通则0102），应符合规定。

　　3.4.2.3  可见异物

　　依法检查（通则0904），应符合规定。

　　3.4.2.4  渗透压摩尔浓度

　　依法测定（通则0632），应符合批准的要求。

　　3.4.3  化学检定

　　3.4.3.1  水分

　　应不高于3.0%（通则0832）。

　　3.4.3.2  pH值

　　复溶后pH值应在稀释剂pH值的±0.5范围内（通则0631）。

　　3.4.4  效价测定

　　相对效价应为标示量的80%～120%（通则3533）。

　　3.4.5  无菌检查

　　依法检查（通则1101），应符合规定。

　　3.4.6  细菌内毒素检查

　　依法检查（通则1143），应不高于3.5EU/瓶。

稀释剂为氯化钠注射液，稀释剂的生产应符合批准的要求。

　　氯化钠注射液应符合本版药典（二部）的相关规定。

于2～8℃避光保存和运输。自生产之日起，有效期为36个月。

应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定和批准的内容。

中华人民共和国药典：2020年版.三部/国家药典委员会编. —北京：中国医药科技出版社，2020.5 ISBN 978-7-5214-1575-9