10.1 试验项目

　　动物实验：分为方案一（补钙为主的受试物）和方案二（不含钙或不以补钙为主的受试物）两种。

　　10.1.1 体重

　　10.1.2 骨钙含量

　　10.1.3 骨密度

　　10.2 试验原则

　　10.2.1 根据受试样品作用原理的不同，方案一和方案二任选其一进行动物实验。

　　10.2.2 所列指标均为必做项目。

　　10.2.3 使用未批准用于食品的钙的化合物，除必做项目外，还必须进行钙吸收率的测定；使用属营养强化剂范围内的钙源及来自普通食品的钙源（如可食动物的骨、奶等），可以不进行钙的吸收率实验。

　　10.3 结果判定

　　方案一

　　骨钙含量或骨密度显著高于低钙对照组且不低于相应剂量的碳酸钙对照组，钙的吸收率不低于碳酸钙对照组，可判定该受试样品具有有助于改善骨密度的作用。

　　方案二

　　不含钙的产品，骨钙含量或骨密度较模型对照组明显增加，且差异有显著性，可判定该受试样品具有有助于改善骨密度的作用。

　　不以补钙为主（可少量含钙）的产品，骨钙含量或骨密度较模型对照组明显增加，差异有显著性，且不低于相应剂量的碳酸钙对照组，钙的吸收率不低于碳酸钙对照组，可判定该受试样品具有有助于改善骨密度的作用。

　　有助于改善骨密度作用检验方法根据受试样品作用原理的不同，分为方案一（补钙为主的受试物）和方案二（不含钙或不以补钙为主的受试物）两种。

　　1 方案一

　　1.1 实验原理

　　机体中的钙绝大部分储存于骨骼及牙齿中，大鼠若摄入钙量不足会影响机体和骨骼的生长发育，表现为体重，身长，骨长，骨重，骨钙含量及骨密度低于摄食足量钙的正常大鼠。生长期大鼠在摄食低钙饲料的基础上分别补充碳酸钙（对照组）或受试含钙产品（实验组），比较两者在促进机体及骨骼的生长发育，增加骨矿物质含量和增加骨密度功能上的作用，从而对受试样品有助于改善骨密度的功能进行评价。

　　1.2 仪器和试剂

　　1.2.1 仪器：原子吸收分光光度计、骨密度仪（双能 X 线骨密度仪、或单光子骨密度仪或相关仪器）、精密卡尺、动物解剖器械、动物天平、105℃烘箱。

　　1.2.2 硝酸，优级纯

　　高氯酸，优级纯

　　氧化镧，2%氧化镧溶液 称取分析纯氧化镧（含量大于 99.99%）25 克，加 75mL 优级纯盐酸，加去离子水至 1000mL。

　　钙标准溶液 称取 1.2486 克分析纯碳酸钙（纯度大于 99.99%），加 50mL 去离子水，加盐酸使之溶解。移入 1000mL 容量瓶中，加 2%氧化镧溶液至刻度。此溶液 1.00mL 相当于 500μg 钙。储于聚乙烯瓶中，4℃保存，临用时稀释。

　　1.3 实验方法

　　1.3.1 实验动物

　　出生 4 周左右的断乳大鼠，体重约 60－75 克，同一性别，每组 8－12 只。

　　1.3.2 基础饲料：用此基础饲料配制低钙对照组以及各剂量组。

　　①需高压处理后用

　　②混合盐：每 kg 混合盐中各组份含量：KH₂PO₄，501.4g；NaCl，74.0g；MgCO₃，50.2g；乳酸亚铁，5.4g；乳酸锌，4.16g；MnCO₃，3.5g；CuSO₄·5H₂O，0.605g；Na₂SeO₃，6.6mg；KI，7.76mg；Cr₃Cl·6H₂O，0.292g；加蔗糖到 1kg。

　　③混合维生素：每 kg 混合维生素中各组份含量：维生素 A，400,000IU；维生素 D3，100,000IU；维生素 E，500IU；维生素 K，5mg；维生素 B₁，600mg；维生素 B₂，600mg；维生素 B₆，700mg；维生素 B₁₂，1mg；尼克酸，3g；叶酸，200mg；泛酸钙，1.6g；生物素，20mg；加蔗糖到 1kg。

　　④可根据各组待测受试物（或碳酸钙）的需用量调节淀粉用量。

　　1.3.3 剂量分组及受试样品给予时间

　　实验设三个剂量组，以人体推荐量的 5 倍为其中的一个剂量组，另设二个剂量组，同时设一个低钙对照组（150mg/100g 饲料）和与相应剂量受试物钙水平相同的碳酸钙对照组（如仅设一个碳酸钙对照组，推荐设立与高剂量钙水平相同的碳酸钙对照组）。用低钙对照组（150mg/100g 饲料）饲料配制受试样品各剂量组和碳酸钙对照组。受试样品给予时间 3 个月。

　　1.3.4 受试物给予途径

　　经口灌胃给予受试物，无法灌胃时将受试物掺入饲料，并记录每只动物的饲料摄入量。

　　1.3.5 实验步骤

　　出生 4 周的断乳大鼠经适应期一周后，禁食 12 小时，称体重，按体重随机分组，分笼饲养。饮用去离子水以避免从饮水中获得钙。

　　1.4 观察指标

　　1.4.1 体重测定：

　　禁食 12 小时后，测定体重。每周一次。

　　1.4.2 股骨重量测定:

　　动物喂养 3 个月后处死，剥离出右侧股骨，于 105℃烤箱中烤至恒重，称量骨干重。

　　1.4.3 股骨骨密度测定:

　　用骨密度仪，（双能 X 线骨密度仪、或单光子骨密度仪或相关仪器）测量股骨中点及股骨远心端的骨密度。

　　1.4.3.1 在股骨远心端及股骨中点画出标记以确定测量点。

　　股骨中点测量点的确定：测量股骨全长，通过其中点，沿横截面方向画一直线，此为股骨中点测量点（截面）。

　　股骨远心端测量点的确定：于股骨远心端关节凹槽最下缘处确定测量点，通过此点，画一与上述股骨中点处标记平行的直线，此为股骨远心端测量点（截面）。

　　1.4.3.2 测量前用骨模型对仪器进行校准。

　　1.4.3.3 经校准可以使用后，继续测定骨模型并与其标准值进行比较，误差不得超过 3%。

　　1.4.3.4 双能 X 线骨密度仪或单光子骨密度仪参数设定：

　　测定方式：精密

　　扫描次数：2 次

　　扫描方式：自动

　　探测域值：99%

　　1.4.3.5 测量股骨中点及股骨远心端骨密度。

　　将待测骨放置于测量台上与骨密度仪探测头移动方向垂直；移动待测骨，令其待测点标记线与探测头移动轨迹于测量台上的垂直投影重合。开始测量，每点应重复测定两次，如两次结果不平行（误差大于 10%），应当重新测量。将两次结果取平均值，以 BW（骨宽）除 BMC（骨矿物质含量），其结果即为 BMD（骨密度）。

　　1.4.4 骨钙含量及饲料含钙量测定：

　　用原子吸收法测量。

　　1.4.4.1 样品采集与制备

　　1.4.4.1.1 饲料样品经均匀混合并过 20 目筛，在烘箱中烘干，置干燥器中冷却后称重，磨细。注意防止在样品制备过程中的污染。

　　1.4.4.1.2 取大鼠一侧股骨在 105℃烘箱中烘干至恒重后，置于三角瓶中进行消化。

　　1.4.4.2 样品消化

　　根据样品中钙的含量，准确称取 0.300~1.00 克，置于 150mL 三角瓶中，上盖小漏斗，加入混合酸（硝酸：高氯酸=4：1）15~20mL，在电热板上加热消化直至冒白烟并透明无色。酸液不够时可以再加入少量混合酸。消化液透明无色后加数毫升去离子水，煮沸以赶除剩余的酸，重复两次，最后消化液的体积不超过 1mL。

　　消化样品时应同时作空白试验，加入与样品消化时相同体积的混合酸，在相同条件下消化。

　　1.4.4.3 测定

　　按照原子吸收分光光度计仪器说明书的步骤进行。测定液、标准溶液和空白均用 0.5%氧化镧溶液稀释，定容。

　　1.5 数据处理及结果判定

　　实验数据采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算 F 值，F 值<F_0.05，结论：各组均数间差异无显著性；F 值≥F_0.05，P≤0.05，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。

　　结果判定

　　骨钙含量或骨密度显著高于低钙对照组且不低于相应剂量碳酸钙对照组，钙的吸收率不低于碳酸钙对照组，可判定受试物具有有助于改善骨密度的作用。

　　2 方案二

　　2.1 实验原理

　　雌性成年大鼠切除卵巢后，骨代谢增强，并发生骨重吸收（破骨）作用大于骨生成（成骨）作用的变化。

　　这种变化表现为骨量丢失，经过一定时间的积累，可以造成骨密度降低模型。在建立模型的同时或模型建立之后给模型实验组大鼠补充受试样品，通过受试物抑制破骨或促进成骨等骨代谢调节作用，观察其在增加骨密度功能及骨钙含量的效果，从而对受试样品有助于改善骨密度的功能进行评价。

　　2.2 实验动物

　　Wistar 或 SD 雌性大鼠，300 克左右，实验前适应 1 周。

　　2.3 饲料配方

　　参照 AIN93 饲料配方配制半成品饲料，用适当的物质替换饲料中来源于大豆的成分，以避免大豆异黄酮等植物雌激素对实验结果的干扰。参考配方见下表。

　　1 含有（mg/kg 饲料）： MnSO₄ 110，CuSO₄ 0.8，FeSO₄ 1.2，KI 18.0，ZnSO₄ 2，960，CaHPO₄ 2，890，MgSO 1.25×104。

　　2 含有（/kg 饲料）： VitA 1.4×104IU，VitD 1，500 IU，VitE 120mg，VitK 3mg，VitB₁ 12mg，VitB₂ 20mg，VitB₆ 12mg，VitB₁₂ 0.03mg，烟酸 60mg，泛酸 24mg，叶酸 6mg，生物素 0.54mg。

　　2.4 仪器和试剂

　　2.4.1 仪器：原子吸收分光光度计、双能 X 线骨密度仪、单光子骨密度仪、精密卡尺、动物解剖器械、动物天平、105℃烘箱。

　　2.4.2 试剂

　　硝酸，优级纯

　　高氯酸，优级纯

　　氧化镧，2%氧化镧溶液 称取分析纯氧化镧（含量大于 99.99%）25g，加 75mL 优级纯盐酸，加去离子水至 1000mL。

　　钙标准溶液 称取 1.2486g 分析纯碳酸钙（纯度大于 99.99%），加 50mL 去离子水，加盐酸使之溶解。移入 1000mL 容量瓶中，加 2％氧化镧溶液至刻度。此溶液 1.00mL 相当于 500g 钙。储于聚乙烯瓶中，4℃保存，临用时稀释。

　　2.5 实验设计和实验剂量

　　2.5.1 卵巢切除术及术后筛查

　　大鼠经腹腔注射 30 mg/kg BW 的戊巴比妥钠溶液麻醉，腹位固定后于腹中线距阴道口 3－4cm 处去毛，分别用碘酒和酒精消毒，待稍干后切开皮肤和腹肌约 2－3cm，切口视野可见白色脂肪，拨开脂肪层找到子宫后，轻轻将一侧子宫角拉出，在其末端可见被脂肪团包裹的卵巢。分离脂肪团，便可见到粉红色或黄红色的卵巢，以止血钳夹住卵巢，然后将卵巢下输卵管（包括脂肪）用丝线结扎，剪除卵巢（检查是否完全剪除），顺势将子宫角送回腹腔中，同法剪除另侧卵巢。腹肌和皮肤分层缝合后，再次消毒。最后经后肢肌肉注射 2万 U 青霉素。也可经背部肋脊角切口行卵巢切除术。为保证手术成功，大鼠摘除卵巢后 5 天，进行阴道涂片检查（用滴管吸取少量生理盐水，轻轻插入阴道 1－2cm，冲洗数次后吸出，涂于玻片上，镜下观察），每天一次，连续 7 天，以检查大鼠卵巢是否完全摘除；如涂片呈动情反应（镜下见大量半透明、扁平的表皮细胞），表明动物卵巢切除不完全，应弃去不用。有经验者可不进行术后筛查。

　　2.5.2 动物分组

　　大鼠经适应性饲养后分组，实验动物按体重随机分组为假手术组、切除卵巢组＋溶剂组、切除卵巢＋低剂量受试物组、切除卵巢＋中剂量受试物组、切除卵巢＋高剂量受试物组。必要时设切除卵巢＋阳性对照组（具雌激素活性的物质）。每组动物 8－12 只。

　　2.5.3 剂量分组及受试样品给予时间

　　如果受试物为不含钙产品，实验设三个剂量组和一个阴性对照组，以人体推荐量的 5 倍为其中的一个剂量组，另设二个剂量组，必要时设阳性对照组。如果受试物是不以补钙为主（可少量含钙）的产品，在根据成人每公斤人体推荐量设置三个剂量受试物组的基础上，可再设与相应受试物钙水平相似的碳酸钙对照组。

　　（如仅设一个碳酸钙对照组，推荐设立与高剂量钙相同的碳酸钙对照组。）各组动物手术后 3－5 天开始灌胃给予受试物或溶剂，无法灌胃时将受试物掺入饲料，并记录每只动物的饲料摄入量。要考虑饲料中是否存在大豆异黄酮对结果的影响。受试物给予时间 3 个月。

　　2.6 观察指标

　　2.6.1 体重

　　2.6.2 骨钙测定

　　2.6.2.1 样品采集与制备

　　取大鼠一侧股骨在 105℃烘箱中烘干至恒重后，称量骨干重，置于三角瓶中进行消化。

　　2.6.2.2 样品消化

　　根据样品中钙的含量，准确称取 0.300~1.00g，置于 150mL 三角瓶中，上盖小漏斗，加入混合酸（硝酸：高氯酸=4：1）15~20mL，在电热板上加热消化直至冒白烟并透明无色。酸液不够时可以再加入少量混合酸。

　　消化液透明无色后加数毫升去离子水，煮沸以赶除剩余的酸，重复两次，最后消化液的体积不超过 1mL。

　　消化样品时应同时作空白试验，加入与样品消化时相同体积的混合酸，在相同条件下消化。

　　2.6.2.3 测定

　　原子吸收法或化学法测定骨钙含量。

　　2.6.3 骨密度测定：用骨密度仪测定股骨中点和股骨远心端骨密度。

　　2.6.3.1 在股骨远心端及股骨中点画出标记以确定测量点。

　　股骨中点测量点的确定：测量股骨全长，通过其中点，沿横截面方向画一直线，此为股骨中点测量点（截面）。

　　股骨远心端测量点的确定：于股骨远心端关节凹槽最下缘处确定测量点，通过此点，画一与上述股骨中点处标记平行的直线，此为股骨远心端测量点（截面）。

　　2.6.3.2 测量前用骨模型对仪器进行校准。

　　2.6.3.3 经校准可以使用后，继续测定骨模型并与其标准值进行比较，误差不得超过 3%。

　　2.6.3.4 骨密度仪参数设定

　　测定方式：精密

　　扫描次数：2 次

　　扫描方式：自动

　　探测域值：99%

　　2.6.3.5 测量股骨中点及股骨远心端骨密度

　　将待测骨放置于测量台上与骨密度仪探测头移动方向垂直；移动待测骨，令其待测点标记线与探测头移动轨迹于测量台上的垂直投影重合。开始测量，每点应重复测定两次，如两次结果不平行（误差大于 10%），应当重新测量。将两次结果取平均值，以 BW（骨宽）除 BMC（骨矿物质含量），其结果即为 BMD（骨密度）。

　　2.7 数据处理和结果判定

　　实验数据采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算 F 值，F 值<F_0.05，结论：各组均数间差异无显著性；F 值≥F_0.05，P≤0.05，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。

　　结果判定

　　不含钙的产品，卵巢切除+溶剂组骨钙含量或骨密度显著低于假手术组，表明造成大鼠骨密度低下模型；卵巢切除+受试物组的骨钙含量或骨密度较卵巢切除+溶剂组显著增加，而其它指标（体重除外）不显著低于卵巢切除+溶剂组，可判定受试物具有有助于改善骨密度作用。

　　不以补钙为主（可含少量钙）的产品，卵巢切除+溶剂组骨钙含量或骨密度显著低于假手术组，表明造成大鼠骨密度低下模型；卵巢切除+受试物组的骨钙含量或骨密度较卵巢切除+溶剂组显著增加，且不低于相应剂量的 CaCO₃对照组，而其它指标（体重除外）不显著低于卵巢切除+溶剂组，可判定受试物具有有助于改善骨密度作用。

　　附录：钙吸收实验

　　1 原理

　　在稳定状态下测定大鼠摄入的钙量及粪便中排出的钙量，两者的差值即为表观吸收的钙。

　　钙的表观吸收率（%）=（摄入钙-粪钙）/摄入钙×100%

　　由于钙的吸收率受鼠龄、性别、饲料成分及钙摄入水平的影响较大，应在其他影响因素尽可能相同条件下，将受试样品与碳酸钙的吸收率进行比较，对受试样品钙的吸收率进行评价。

　　2 仪器及试剂

　　2.1 代谢鼠笼

　　2.2 动物天平

　　2.3 原子吸收分光光度计：具火焰法测定装置氘灯背景扣除

　　2.4 硝酸：优级纯

　　2.5 高氯酸：优级纯

　　2.6 2%氧化镧溶液：称取分析纯氧化镧（含量>99.99%）25g，加 75mL 优级纯盐酸，加去离子水至 1000mL。

　　2.7 钙标准溶液：称取 1.2486g 分析纯碳酸钙（纯度大于 99.99%），加 50 mL 去离子水，加盐酸使之溶解。

　　移入 1000 mL 容量瓶中，加 2%氧化镧溶液至刻度。此溶液 1.00mL 相当于 500μg 钙。储于聚乙烯瓶中，4℃保存，临用时稀释。

　　3 实验方法

　　3.1 实验动物：出生 4 周左右的断乳大鼠

　　3.2 基础饲料：低钙饲料配方见表 1

　　4 动物分组及剂量设置

　　实验设三个剂量组，以人体推荐量的 5 倍为其中的一个剂量组，另设二个剂量组，同时设一个低钙对照组（150mg/100g 饲料）和与相应剂量受试物钙水平相同的碳酸钙对照组（如仅设一个碳酸钙对照组，推荐设立与高剂量钙水平相同的碳酸钙对照组）。用低钙对照组（150mg/100g 饲料）饲料配制受试样品各剂量组和碳酸钙对照组。

　　4.1 生长发育

　　出生四周的断乳大鼠经适应期 1 周后，分笼饲养 4 周。每组至少有同一性别动物 8 只。饮用去离子水以避免从饮水中获得钙。每周测量身长、体重一次。

　　4.2 代谢实验

　　实验 3 周后进行 3 天钙代谢实验。记录 3 天进食量，收集 72 小时粪便，测定饲料及粪便中钙含量。

　　4.3 饲料及粪便中钙的测定方法：用原子吸收分光光度法进行测定

　　4.3.1 样品采集与制备：饲料样品经均匀混合并过 20 目筛；鼠粪样品在 80℃烘箱中烘干，置干燥器中冷却后磨细。注意防止在样品制备过程中的污染。

　　4.3.2 样品消化：根据样品中钙的含量，精确称取烘干磨细的均匀样品 0.30－1.00g，置于 150mL 三角瓶中，上盖小漏斗。加入混合酸（硝酸:高氯酸=4:1）15－20mL，在电热板上加热消化直至消化液冒白烟并透明无色。酸液不够时可以再加少量混合酸。消化液透明无色后加数毫升去离子水，煮沸以赶除剩余的酸，重复两次，最后消化液的体积不超过 1mL。消化样品时应同时作空白实验，加入与受试样品消化时相同体积的混合酸，在相同条件下消化。消化液转移至容量瓶并用去离子水定容。

　　4.3.3 测定：按照原子吸收分光光度计仪器说明书的步骤进行。测定液、标准溶液和空白均用氧化镧溶液稀释。

　　4.4 计算

　　摄入钙（mg/d）=饲料中钙含量（mg/g）×饲料消费量（g/d）

　　粪钙（mg/d）=粪便中钙含量（mg/g）×粪便排出量（g/d）

　　4.5 饲料及鼠粪中钙的测定也可用滴定法进行（详见 GB 12398.90）。

　　5 数据处理及结果判定

　　数据采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算 F 值，F 值<F_0.05，结论：各组均数间差异无显著性；F 值≥F_0.05，P≤0.05，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。

　　受试样品组动物喂养 4 周时的身长、体重如显著低于相同钙摄入水平的对照组动物，或受试样品所含钙的吸收率显著低于相同钙摄入水平碳酸钙的吸收率则应判定为不能作为补钙产品。

　　受试样品钙的吸收率如与相同钙摄入水平的碳酸钙相近而无显著性差异，受试样品可以作为补钙剂。

　　受试样品钙的吸收率若在两种钙摄入水平上均显著高于相同水平碳酸钙，则可以判定受试样品为“钙吸收率较高”。