23.1 实验项目

　　23.1.1 体重

　　23.1.2 外周血白细胞计数

　　23.1.3 骨髓细胞DNA含量或骨髓有核细胞数

　　23.1.4 小鼠骨髓细胞微核实验

　　23.1.5 血／组织中超氧化物歧化酶活性实验

　　23.1.6 血清溶血素含量实验

　　23.2 实验原则

　　外周血白细胞计数、骨髓细胞DNA含量或骨髓有核细胞数、小鼠骨髓细胞微核实验、血／组织中超氧化物歧化酶活性实验、血清溶血素含量实验中任选择三项进行实验。

　　23.3 结果判定

　　在外周血白细胞计数、骨髓细胞DNA含量或骨髓有核细胞数、小鼠骨髓细胞微核、血／组织中超氧化物歧化酶活性、血清溶血素含量五项实验中任何二项实验结果阳性，可判定该受试样品具有对电离辐射危害有辅助保护作用功能的作用。

　　1 外周血白细胞计数实验

　　1.1 原理

　　外周血白细胞数减少是一次性全身γ射线照射引起辐射损伤的表现之一，在一定范围内，照射剂量与外周血中白细胞数成反比，恢复时间与外周血中白细胞数成正比，外周血中白细胞数可代表血液系统受损的状况。

　　1.2 仪器和试剂

　　20μL定量取血管、血球计数板、显微镜、1%盐酸等。

　　1.3 实验方法

　　1.3.1 实验动物：小鼠，18－22g，单一性别，每组10－15只。

　　1.3.2 剂量分组及受试样品给予时间

　　实验设三个剂量组和一个辐射模型对照组，以人体推荐量的10倍为其中的一个剂量组，另设二个剂量组，必要时设阳性对照组。受试样品于照射前给予14－30天，照射后仍然给予受试物，必要时可延长至45天。

　　1.3.3 实验步骤

　　受试样品组于照射前后经口连续给予受试样品，剂量组与辐射模型对照组均以同一剂量γ射线全身照射一次，照射剂量宜选择3Gy－5Gy。分别于照射前、照射后第3天、照射后第14天三次采末梢血20μL，加入0.38mL1%盐酸中，混匀后，加入血球计数板中，计算计数池中四个大方格中白细胞总数。

　　1.4 数据处理及结果判定

　　白细胞数为计量资料，采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值<F_0.05，结论：各组均数间差异无显著性；F值≥F_0.05，P≤_0.05，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。

　　照射前的外周血白细胞计数，用于各组间白细胞数目的均衡性检验，剂量组与辐射模型对照组比较，差异无显著性，再进行照射及后续实验。

　　照射后3天辐射模型对照组的白细胞数分别与照射前进行自身比较，差异有显著性，则判定辐射损伤模型成立；任一时间点、任一剂量组与辐射模型对照组比较，白细胞总数增多，差异有显著性，则可判定该实验阳性。

　　2 骨髓细胞DNA含量或骨髓有核细胞数实验

　　2.1 原理

　　骨髓细胞DNA含量或骨髓有核细胞数降低是一次性全身γ射线照射引起辐射损伤的表现之一，在一定范围内，照射剂量与骨髓细胞DNA含量或骨髓有核细胞数成反比，恢复时间与骨髓细胞DNA含量或骨髓有

　　核细胞数成正比，骨髓细胞DNA含量或骨髓有核细胞数可代表造血系统受损的状况。

　　2.2 仪器和试剂

　　血球计数板、显微镜、注射器、手术器械、紫外分光光度计、Hank’s液等。

　　2.3 实验方法

　　2.3.1 实验动物：小鼠，18－22g，单一性别，每组10－15只。

　　2.3.2 剂量分组及受试样品给予时间

　　实验设三个剂量组和一个辐射模型对照组，以人体推荐量的10倍为其中的一个剂量组，另设二个剂量组，必要时设阳性对照组。受试样品于照射前给予14－30天，照射后仍然给予受试物，必要时可适当延长至45天。

　　2.3.3 实验步骤

　　受试样品组于照射前后经口连续给予受试样品，剂量组与辐射模型对照组均以同一剂量γ射线全身照射一次，照射剂量宜选择3Gy－5Gy。于照射后第3天，颈椎脱臼处死动物，剥离出股骨，用1mL注射器（6.5号针头）吸取一定体积的Hank’s液，冲出股骨中的全部骨髓细胞；最后，让细胞悬液通过4号针头的注射器，使细胞在悬液中充分分散。

镜下计数。计算每mL骨髓细胞悬液中的有核细胞数。

或用紫外分光光度计260nm处测定DNA含量。

　　2.4 数据处理及结果判定

　　骨髓有核细胞数或骨髓细胞DNA含量为计量资料，采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值<F_0.05，结论：各组均数间差异无显著性；F值≥F_0.05，P≤0.05，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。

　　任一剂量组与辐射模型对照组比较，骨髓有核细胞数或骨髓细胞DNA含量增多，差异有显著性，则可判定该实验阳性。

　　3 小鼠骨髓细胞微核实验

　　3.1 原理

　　骨髓细胞微核数增高是一次性全身γ射线照射引起辐射损伤的表现之一，在一定范围内，照射剂量与骨髓细胞微核率成正比，恢复时间与骨髓细胞微核率成反比，骨髓细胞微核数可代表机体染色体受损的状况。

　　3.2 仪器和试剂

　　解剖器械，生物显微镜，载玻片等。

小牛血清：小牛血清滤菌后放入56℃恒温水浴保温1h进行补体活性灭活。－20℃保存。亦可用大、小鼠血清代替。

　　Giemsa染液及应用液

　　1/15mol/L磷酸盐缓冲液（pH6.8）

　　甲醇（分析纯）

　　3.3 实验方法

　　3.3.1 实验动物：小鼠，体重18－22g，单一性别，每组10－15只。

　　3.3.2 剂量分组及受试样品给予时间

　　实验设三个剂量组和一个辐射模型对照组，以人体推荐量的10倍为其中的一个剂量组，另设二个剂量组，必要时设阳性对照组。受试样品于照射前给予14－30天，照射后仍然给予受试物，必要时可适当延长至45天。

　　3.3.3 实验步骤：

　　受试样品组于照射前后经口连续给予受试样品，剂量组与辐射模型对照组均以同一剂量γ射线全身照射一次，照射剂量宜选择3Gy－5Gy。于照射后第3天，颈椎脱臼处死动物，取胸骨或股骨，用止血钳挤出骨髓液与玻片一端的小牛血清混匀，常规涂片。或用小牛血清冲洗股骨骨髓腔制成细胞悬液涂片，涂片自然干燥后，放入甲醇中固定5－10min，放入Giemsa应用液中，染色10－15min，立即用磷酸盐缓冲液或蒸馏水冲洗，晾干。镜检，每只动物计数1000个嗜多染红细胞中微核细胞数，微核率以千分率表示。

抑制率计算：

　　3.4 数据处理及结果判定

　　采用卡方检验、泊松分布或方差分析等统计方法进行数据处理。

任一剂量组微核率低于辐射模型对照组微核率，差异有显著性，可判定该实验结果阳性。

　　4 血／组织中超氧化物歧化酶（SOD）活性实验

　　4.1 原理

　　血／组织中超氧化物歧化酶（SOD）活性降低是一次性全身γ射线照射引起辐射损伤的表现之一，在一定范围内，照射剂量与血／组织中超氧化物歧化酶（SOD）活性成反比，恢复时间与血／组织中超氧化物歧化酶（SOD）活性成正比，血／组织中超氧化物歧化酶（SOD）活性可代表机体氧化还原反应系统受损的状况。

　　O2^－氧化羟基的最终产物为亚硝酸盐，后者在对氨基苯磺酸及甲萘胺作用下呈现紫红色，在波长530nm

　　处有最大吸收峰，可用分光光度法进行测定，当SOD消除O2^－后形成的亚硝酸盐减少。

　　4.2 仪器与试剂

　　仪器721分光光度计、离心机、恒温水浴、匀浆器

　　试剂

　　1/15mol/L磷酸盐缓冲液（PBS）pH7.8、SOD标准品、三氯甲烷、95%乙醇（v/v）、0.9%生理盐水

　　10mmol/L盐酸羟胺

　　盐酸羟胺6.95mg，加PBS至10mL

　　7.5mmol/L黄嘌呤

　　黄嘌呤11.41mg，加0.1MNaOH2.5mL溶解，加PBS至10mL

　　0.2mg/mL黄嘌呤氧化酶

　　取10mg/mL黄嘌呤氧化酶0.2mL加冰冷PBS9.8mL至10mL

　　0.1%甲萘胺

　　取0.2gα-甲萘胺溶于40mL沸蒸馏水，凉至室温加50mL冰醋酸，再加110mL凉蒸馏水至200mL

　　0.33%对氨基苯磺酸

　　取0.66g对氨基苯磺酸溶于150mL温蒸馏水，加50mL冰醋酸至200mL

　　4.3 实验方法

　　4.3.1 实验动物：小鼠，体重18－22g，单一性别，每组10－15只。

　　4.3.2 剂量分组及受试样品给予时间

　　实验设三个剂量组和一个辐射模型对照组，以人体推荐量的10倍为其中的一个剂量组，另设二个剂量组，必要时设阳性对照组。受试样品于照射前给予14－30天，照射后仍然给予受试物，必要时可适当延长至45天。

　　4.3.3 实验步骤

　　受试样品组于照射前后经口连续给予受试样品，剂量组与辐射模型对照组均以同一剂量γ射线全身照射一次，照射剂量宜选择6Gy－8Gy。于照射后第7天，进行实验。

　　4.3.3.1 红细胞抽提液制备：10μL全血冲入0.5mL生理盐水，2000r/min离心3min，弃上清，加冰冷的双蒸水0.2mL混匀，加入95%乙醇0.1mL，振荡30s，加入三氯甲烷0.1mL，置快速混合器抽提1min，4000r/min离心3min，分层，上层为SOD抽提液，中层为血红蛋白沉淀物，下层为三氯甲烷，记录上清液体积待测。

　　4.3.3.2  组织匀浆的制备：剪取一定量的所需脏器，生理盐水冲洗、拭干、称重、剪碎，至玻璃匀浆器中加入冷生理盐水20000r/min匀浆10s，间歇30s，反复进行三次，制成1%组织匀浆，（最好用超声波发生器处理30s），使线粒体振破，以中性红－詹钠氏绿B染色证明线粒体已振碎。以4000r/min离心5min，取上清液20μL待测。

　　4.3.3.3 SOD标准抑制曲线将SOD标准品用磷酸盐缓冲液配制成750U/mL的溶液，再稀释到50倍，即SOD量为15U/mL（1.5μg/mL），用本法测定不同量的SOD标准液的百分抑制率，以百分抑制率为纵坐标，以SOD活力单位U/mL为横坐标绘制标准曲线。

　　计算

　　每mL反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为一个单位。

　　也可用酶比活法即以每管样品的百分抑制率从SOD标准曲线查出相应的SODU/mL，乘以稀释倍数（1mL/取样量）。

　　若样品为组织匀浆液，根据匀浆浓度或组织蛋白质含量，将单位换算为U/g组织或U/mg蛋白。若样品为红细胞抽提液，根据血红蛋白含量，可换算为U/gHb。

　　4.4 数据处理及结果判定

　　SOD活性值为计量资料，采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值<F_0.05，结论：各组均数间差异无显著性；F值≥F_0.05，P≤0.05，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。

　　任一剂量组与辐射模型对照组比较，血／组织中SOD活性增强，差异有显著性，则可判定该实验阳性。

　　5 血清溶血素实验

　　5.1 原理

　　免疫系统是机体辐射损伤较敏感的组织之一，血清溶血素值可代表体液免疫系统的状况。在一定范围内，照射剂量与血清中溶血素水平成反比，恢复时间与血清中溶血素水平成正比，血清中溶血素可代表机体体液免疫系统受损的状况。

　　5.2 实验方法

　　5.2.1 实验动物：小鼠，18－22g，单一性别，每组10－15只。

　　5.2.2 剂量分组及受试样品给予时间

　　实验设三个剂量组和一个辐射模型对照组，以人体推荐量的10倍为其中的一个剂量组，另设二个剂量组，必要时设阳性对照组。受试样品于照射前给予14－30天，照射后仍然给予受试物，必要时可适当延长至45天。

　　5.2.3 实验步骤

　　受试样品组于照射前后经口连续给予受试样品，剂量组与辐射模型对照组均以同一剂量γ射线全身照射一次，照射剂量宜选择1Gy－3Gy。于照射后20天内，进行血清溶血素的测定。（可任选下列方法之一）

　　5.2.3.1 血凝法

　　5.2.3.1.1 原理

　　用SRBC免疫动物后，产生抗SRBC抗体（溶血素），利用其凝集SRBC的程度来检测溶血素的水平。

　　5.2.3.1.2 仪器和材料

　　SRBC、生理盐水、微量血凝实验板、离心机。

　　5.2.3.1.3 实验步骤

　　5.2.3.1.3.1 SRBC绵羊颈静脉取血，将羊血放入有玻璃珠的灭菌锥形瓶中，朝一个方向摇动，以脱纤维，放入4℃冰箱保存备用，可保存2周。

　　5.2.3.1.3.2 免疫动物及血清分离取羊血，用生理盐水洗涤3次，每次离心（2000r/min）10min。将压积SRBC用生理盐水配成2%（v/v）的细胞悬液，每只鼠腹腔注射0.2mL进行免疫。4～5天后，摘除眼球取血于离心管内，放置约1h，将凝固血与管壁剥离，使血清充分析出，2000r/min离心10min，收集血清。

　　5.2.3.1.3.3 凝集反应用生理盐水将血清倍比稀释，将不同稀释度的血清分别置于微量血凝实验板内，每孔100μL，再加入100μL0.5%（v/v）的SRBC悬液，混匀，装入湿润的平盘内加盖，于37℃温箱孵育3h，观察血球凝集程度。

　　血清凝集程度一般分为5级（0－IV）记录，按下式计算抗体积数，抗体水平＝（S1+2S2+3S3……nSn）式中1、2、3……n代表对倍稀释的指数，S代表凝集程度的级别，抗体积数越大，表示血清抗体越高。

　　0级 红细胞全部下沉，集中在孔底部形成致密的圆点状，四周液体清晰。

　　I级 红细胞大部分沉集在孔底成圆点状，四周有少量凝集的红细胞。

　　II级 凝集的红细胞在孔底形成薄层，中心可以明显见到一个疏松的红点。

　　III级 凝集的红细胞均匀地铺散在孔底成一薄层，中心隐约可见一个小红点。

　　IV级 凝集的红细胞均匀地铺散在孔底成一薄层，凝块有时成卷折状。

　　5.2.3.1.4 数据处理及结果判定

　　抗体积数为计量资料，采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值<F_0.05，结论：各组均数间差异无显著性；F值≥F_0.05，P≤0.05，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。

　　受试样品组的抗体积数显著高于模型对照组的抗体水平，可判定该项实验结果阳性。

　　5.2.3.1.5 注意事项

　　血清稀释时要充分混匀。最后一个稀释度应不出现凝集现象。

　　5.2.3.2 半数溶血值（HC₅₀）的测定

　　5.2.3.2.1 原理

　　用SRBC免疫动物后，产生抗SRBC抗体（溶血素），与SRBC一起孵育，在补体参与下，可发生溶血反应，释放血红蛋白，通过测定血红蛋白含量反映动物血清中溶血素的含量。

　　5.2.3.2.2 仪器和材料

　　721分光光度计、离心机、恒温水浴、SRBC、补体（豚鼠血清）、SA缓冲液、都氏试剂（碳酸氢钠1.0g、高铁氰化钾0.2g、氰化钾0.05g，加蒸馏水至1000mL）。

　　5.2.3.2.3 实验步骤

　　5.2.3.2.3.1SRBC 绵羊颈静脉取血，将羊血放入有玻璃珠的灭菌锥形瓶中朝一个方向摇动，以脱纤维，放入4℃冰箱保存备用，可保存2周。

　　5.2.3.2.3.2 制备补体采集豚鼠血，分离出血清（至少5只豚鼠的混合血清），将1mL压积SRBC加入到5mL豚鼠血清中，放4℃冰箱30min，经常振荡，离心取上清，分装，－70℃保存。用时以SA液按1∶8稀释。

　　5.2.3.2.3.3 免疫动物及血清分离取羊血，用生理盐水洗涤3次，每次离心（2000r/min）10min。将压积SRBC用生理盐水配成2%（v/v）的细胞悬液，，每只鼠腹腔注射0.2mL进行免疫。4～5天后，摘除眼球取血于离心管内，放置约1h，使血清充分析出，2000r/min离心10min，或6000r/min，4min，收集血清。

　　5.2.3.2.3.4 溶血反应取血清用SA缓冲液稀释（一般为200～500倍）。将稀释后的血清1mL置试管内，依次加入10%（v/v）SRBC0.5mL，补体1mL（用SA液按1:8稀释）。另设不加血清的对照管（以SA液代替）。置37℃恒温水浴中保温15～30min后，冰浴终止反应。2000r/min离心10min。取上清液1mL，加都氏试剂3mL，同时取10%（v/v）SRBC0.25mL加都氏试剂至4mL，充分混匀，放置10min后，于540nm处以对照管作空白，分别测定各管光密度值。

　　溶血素的量以半数溶血值（HC50）表示，按下列公式计算，

　　5.2.3.2.4 数据处理及结果判定

　　血清溶血素含量为计量资料，采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值<F_0.05，结论：各组均数间差异无显著性；F值≥F_0.05，P≤0.05，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。

　　任一剂量组与辐射模型对照组比较，血清半数溶血值增多，差异有显著性，则可判定该实验阳性。

　　结果判定

　　在外周血中白细胞计数实验、骨髓细胞DNA含量或骨髓有核细胞数实验、小鼠骨髓细胞微核实验、血／组织中超氧化物歧化酶活性实验、血清溶血素含量实验中，任何两项实验结果阳性，可判定该受试样品具有对电离辐射危害有辅助保护作用。